Vectores basados en el genoma del coronavirus TGEV

Resumen

A lo largo de esta memoria se describe la generación de vectores virales basados en el genoma del coronavirus TGEV con el fin de responder preguntas básicas sobre la replicación del virus así como sobre su uso como sistema de expresión de genes heterólogos. Se han construido genomas TGEV con todos los genes separados por sitios de restricción por endonucleasa. La separación de los genes TGEV implicó la duplicación de secuencias del extremo 5' de cada gen, siendo éste un dominio de secuencia asociado con la regulación de la transcripción, que afecta al crecimiento del virus in vivo y a su virulencia. En esta tesis, se aporta la primera demostración de que el gen 7 de TGEV es un gen no esencial para la viabilidad del TGEV. Además, se demuestra que la deleción del gen 7 afecta a la replicación de TGEV, y atenúa su virulencia en lechones, su hospedador natural. Asímismo, se ha mostrado que la introducción de una o más modificaciones en el genoma de TGEV llevó a la generación de una colección de recombiantes de TGEV con un grado variable de virulencia. Por otro lado, se ha determinado que el gen E es esencial desarrollando un genoma de TGEV deficiente en el gen E y en los genes no esenciales 3a y 3b. Para la generación de viriones defectivos en el gen E, éste se ha complementado en trans mediante células empaquetadoras que expresan la proteína E. En ausencia de la proteína E se bloqueó la formación de viriones maduros durante la morfogénesis del virus obteniéndose viriones inmaduros no infectivos que se acumulan en el ERGIC. Asímismo, se han generado vectores con tropismo dirigido a la especie canina mediante la sustitución del dominio globular de la proteína S del TGEV por la del coronavirus canino superando la primera barrera de restricción de la infección, la entrada del virus. Se han desarrollado vectores con tropismo canino competentes en replicación y propagación. Estos conocimientos posibilitan l