Descripción y comparación del perfil de expresión del sistema lin28/let-7 y mircrornas asociados en tejido placentario sano y tejido placentario procedente de embarazos ectópicos

Resumen

INTRODUCCIÓN El embarazo ectópico (EE) es una complicación precoz de la gestación en la cual un óvulo fecundado se implanta en un sitio distinto al endometrio de la cavidad uterina. siendo el lugar más frecuente la trompa de Falopio (95-98%). Su incidencia resulta variable en la literatura médica, oscilando entre el 0,6 y el 2% de los embarazos documentados, presentándose con picos más altos en la adolescencia. Este continúa siendo la principal causa de muerte materna en las primeras etapas de la gestación (4-10% de las muertes relacionadas con el embarazo en países desarrollados) y una de las urgencias quirúrgicas más frecuentes del primer trimestre. El EE no es solo una causa importante de morbilidad y mortalidad asociada con el riesgo de ruptura y hemorragia intraabdominal, sino que puede generar secuelas graves en la vida reproductiva femenina, incluyendo el embarazo ectópico recurrente y la infertilidad. En la actualidad la ecografía transvaginal es la modalidad de imagen de elección para el diagnóstico del embarazo ectópico, permitiendo detectar la localización con precisión en más del 90% de todos los embarazos y en el 73,9% de los embarazos ectópicos, con un único examen. Generalmente requiere asociar la determinación de hCG . Cuando la βhCG alcanza niveles de 1.500 a 2.000 mUI/mL, un embarazo normal único debe mostrar un saco gestacional en el ultrasonido transvaginal. En cualquier caso cuando existan dudas, siempre y cuando la paciente esté estable, se debe repetir la ecografía asociada a una nueva determinación de hCG a las 48 horas. Hasta la fecha se han investigado diversos biomarcadores como la progesterona, la inhibina A, la activina A, la PAAP-A, para intentar conseguir un diagnóstico más precoz y preciso del EE del que podemos realizar en la actualidad, aunque su utilidad clínica es bastante limitada por dos razones principales. En primer lugar, las concentraciones séricas de estos varían en función de la edad gestacional. En segundo lugar, estos son capaces de discriminar entre EE y gestación de curso normal pero no permiten la distinción entre un EE y un aborto. Sería un marcador ideal aquel que sea estable y que permita la distinción entre EE y aborto. En este contexto, los miRNAs serían grandes candidatos a nuevos estudios por su estabilidad y su capacidad de pasar a la sangre periférica. En las últimas décadas, se ha puesto de manifiesto que la regulación de una gran variedad de procesos biológicos no depende únicamente de mecanismos de control transcripcional (regulación genética), sino que engloba igualmente mecanismos epigenéticos como la regulación de la expresión génica por ciertos RNAs pequeños no codificantes (small non-coding RNAs o ncRNA), de entre los que destacan los microRNAs (miRNAs). Los miRNAs son pequeñas moléculas de RNA no codificante, de entre 18-25 nucleótidos (nt) de longitud, que operan como reguladores postranscripcionales de la expresión de numerosos genes diana (Bartel ,2004). Un aspecto muy notable en relación con los miRNAs en general, y los de expresión placentaria en particular, es que éstos pasan al torrente circulatorio donde son detectables mediante técnicas convencionales, tales como stem-loop RT-PCR y arrays. Es destacable el hecho de que los miRNAs son enormemente estables, lo que facilita metodológicamente su detección en muestras congeladas de plasma/suero. En este sentido, diversos estudios de expresión y funcionales han documentado la presumible implicación de familias de miRNAs en la regulación de procesos biológicos diversos. Existen ya numerosas investigaciones acerca de la implicación de los miRNAs en diversas patologías obstétricas y ginecológicas, como la preeclampsia, el retraso de crecimiento intrauterino, el cáncer de cérvix, endometrio y ovario o n la endometriosis. Existen también, estudios publicados sobre miRNAs específicamente expresados en placenta y ya se han relacionado algunos de ellos con el EE. Así mismo, se han observado cambios en la expresión del complejo LIN28/Let-7 en los distintos tejidos embrionarios. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO Dado que no hay publicaciones de casos y controles sobre los cambios en el patrón de expresión de los miRNAS en tejido de EE y menos aún en concreto del sistema LIN28/Let-7, y que existen escasos estudios que se hayan centrado en el comportamiento de la expresión de los miRNAs en fases precoces de la formación placentaria, nos pareció interesante desarrollar este estudio para conocer el papel del sistema LIN28/Let-7 y algunos miRNAs asociados en el tejido placentarios de embarazos normales frente a ectópicos. HIPÓTESIS En situaciones donde ocurre una implantación anómala, como sucede en el embarazo ectópico, el nivel de expresión de miRNAs y en concreto del complejo LIN 28/Let- 7 en el tejido embrionario, probablemente sea diferente al hallado en gestaciones normales. OBJETIVOS 1. Identificar el perfil global de expresión de LIN28/Let -7 y miRNAs asociados (miR-132, miR-145 y mir-323-3p) en tejido embrionario procedente de gestaciones evolutivas sanas con interrupción voluntaria del embarazo en el primer trimestre de la gestación. 2. Identificar el perfil global de expresión de LIN28/Let -7 y miRNAs asociados (miR-132, miR-145 y mir-323-3p) en tejido embrionario procedente de gestaciones ectópicas tubáricas. 3. Comparar y validar el perfil global de expresión de LIN28/Let -7 y miRNAs asociados (miR-132, miR-145 y mir-323-3p) en tejido embrionario procedente de gestaciones ectópicas tubáricas y de gestaciones evolutivas sanas con interrupción voluntaria del embarazo en el primer trimestre de la gestación. MATERIALES Y MÉTODOS Se seleccionaron 43 pacientes con gestaciones intrauterinas normales que habían decidido someterse a una interrupción voluntaria del embarazo (IVE) y 17 pacientes diagnosticadas de EE tubárico (figura 11). Durante el procedimiento quirúrgico ( legrado en el caso de los controles y la salpinguectomía laparoscópica en el caso de los EE) se extrajeron las muestras de tejido embrionario bajo visión de un estereomicroscopio. El tejido seleccionado (0´5-2 cm de placenta), se introducía en tubos de eppendorf rellenados con Trizol® y posteriormente eran congelados a -80 ºC hasta ser cuantificados. Un pequeño fragmento de la pieza se enviaba para estudio anatomopatológico y confirmación del diagnóstico histológico. En el caso de los IVE se obtuvo la muestra tras dilatación cervical y evacuación fetal o mediante legrado por aspiración para obtener el tejido embrionario. Se separó la muestra en el quirófano de la misma forma que los EE y se colocaron inmediatamente en el reactivo Trizol®, para ser congeladas y almacenadas a -80º. Se realizaron los análisis de expresión génica de LIN28, Let-7a, miR -132, miR-145 y miR-323-3p mediante PCR cuantitativa. RESULTADOS Se observó que los niveles relativos de LIN28B en tejido embrionario de gestaciones humanas precoces fueron casi nulos en gestaciones ≤ 6 semanas, produciéndose una diferencia estadística en su expresión en semanas posteriores. De hecho, se detectó un pico muy marcado de sus niveles a partir de la semana 7 para posteriormente mantenerse en meseta hasta las 9 semanas. Al comparar la expresión en gestaciones por debajo de las 6 semanas de amenorrea con los otros subgrupos (amenorrea de 7, 8 y 9 semanas) se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas en todos los casos (*P< 0,05; **P< 0,01; ***P<0,001). Para ello se aplicó el test de ANOVA unidireccional seguido de test de Newman Keuls. Con la expresión del miRNA Let- 7a sucedió justamente lo contrario. Su expresión fue máxima en tejido embrionario  6 semanas para a partir de la semana 7 experimentar una bajada drástica y mantenerse en niveles mínimos hasta la semana 9. Asimismo, encontramos una diferencia estadísticamente significativa entre la expresión de Let-7a en gestaciones  6 semanas y embarazos de 7, 8 y 9 semanas. Se objetivó un comportamiento similar al Let-7a en los casos de miR-132 y miR-145, aunque el descenso en la expresión a partir de la séptima semana en este caso fue más gradual. Los niveles de Let-7a en la semana 7, habían descendido al 80% de su valor máximo, en tanto que para miR-132 y miR-145 habían descendido aproximadamente a la mitad en esta semana. En el caso de miR-132 todas las comparaciones realizadas por subgrupos fueron significativas con respecto al grupo de menos de 6 semanas. Sin embargo, las diferencias de expresión de miR-145 sólo alcanzaron niveles significativos al comparar embarazos de  6 semanas con embarazos de 8 semanas (figura 14), aunque se vieron las mismas tendencias a la baja que en el caso de miR-145. Por otro lado, se observó una tendencia similar a LIN28B en la expresión de miR-323-3p, aunque no hubo un ascenso tan brusco de su expresión en la semana 7. Los niveles fueron mínimos en tejido embrionario de  6 semanas y ascendieron posteriormente hasta alcanzar su máximo nivel a las 9 semanas. Sin embargo, al hacer comparaciones entre la expresión en las distintas semanas de gestación tomando como referencia las de  6 semanas, la diferencia no fue significativa. El análisis de expresión por subgrupos confirmó que el nivel de miRNA LIN28B se incrementa casi 4 veces su valor en tejido embrionario normal, entre las 6 semanas comparado con fases posteriores (7-9 semanas) del embarazo en etapas tempranas. Sin embargo, en las fases más precoces ( 6 semanas) en los EE se observó una expresión del ARNm de LIN28B drásticamente superior a la del grupo control, siendo esta estadísticamente significativa. Sin embargo, esta diferencia desaparecía en fases más tardías del embarazo (7-9 semanas). Por otra parte, en línea con los resultados previos, detectamos un descenso sustancial en los niveles del miRNA Let-7a en el tejido embrionario de gestaciones tempranas normales, entre  6 semanas y etapas posteriores, mientras que en el tejido embrionario patológico del EE, la expresión de Let-7a presentaba niveles mínimos de expresión ya en el grupo de  6 semanas y se mantenía en niveles similares en etapas más avanzadas. Se realizaron análisis similares para los otros miRNAs estudiados en este trabajo. La expresión de miR-132 y miR-145 se reducía al comparar gestaciones ≤ 6 semanas con fases posteriores de embarazos precoces. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas al comparar gestaciones normales con ectópicas. En el caso de mir-145 se observó una expresión aumentada en EE antes de las 6 semanas pero no fue estadísticamente significativa. Por el contrario, los niveles de miR-323-3p, en tejido embrionario normal tendieron a ascender entre ≤ 6 semanas y fases más tardías. Esta diferencia fue significativa cuando se realizó el análisis por subgrupos entre gestaciones ≤ 6 semanas y entre 7-9 semanas. Curiosamente, los niveles de miR-323-3p en EE fueron similares en embarazos ≤ 6 semanas. Sin embargo, el incremento de su expresión en fases más tardías (semanas 7-9) no se obtuvo en los EE, por lo que entre las semanas 7 y 9, la expresión de miR-323-3p en tejido embrionario de EE quedaba por debajo de la del embarazo normal. CONCLUSIONES 1. Existe un drástico aumento de los niveles de expresión de LIN28B en tejido embrionario de gestaciones humanas normales en embarazos con edades gestacionales por encima de las 7 semanas. La expresión de LIN28B en tejido embrionario de gestaciones menores o iguales a 6 semanas es significativamente superior en embarazos ectópicos que en embarazos normales. 2. La expresión de Let-7a fue máxima en tejido embrionario de gestaciones humanas normales menores de 6 semanas para a partir de la semana 7 experimentar un descenso drástico. La expresión de Let-7a en tejido embrionario de gestaciones menores o iguales a 6 semanas fue significativamente inferior en embarazos ectópicos que en embarazos normales. 3. La expresión de mir-132 y mir-145 fue máxima en tejido embrionario de gestaciones humanas normales menores de 6 semanas para a partir de la semana 7 experimentar un descenso en este caso más gradual que el que se observó para Let-7a. Antes de la 6ª semana, la expresión de mir-145 tendió a ser más elevada en tejido embrionario de gestaciones ectópicas que en gestaciones normales, mientras que para miR-132 se observó la tendencia contraria. 4. En gestaciones normales, los niveles de expresión de mir-323-3p se incrementaron significativamente entre las 6 y las 7-9 semanas de gestación. En este periodo (semanas 7 y 9 de embarazo), la expresión de mir-323-3p en tejido embrionario de embarazos ectópicos fue significativamente inferior a la del embarazo normal. 5. En gestaciones normales, la transición entre las 6 y las 7 semanas de edad gestacional marca un cambio drástico y recíproco en los marcadores estudiados. 6. Como conclusión final, observamos que en el tejido embrionario de los embarazos ectópicos existe un incremento del ratio LIN28B/Let-7a desde antes de las 6 semanas, mientras que en gestaciones normales este incremento del ratio se hace esperar hasta la séptima semana de embarazo. Dado el fenotipo pro-proliferativo y de invasión que se asignado al incremento del ratio LIN28B/Let-7 en determinados tejidos, esta diferencia observada entre los casos y los controles podría explicar un papel en la placentación normal versus ectópica.