Desarrollo de nuevas metodologías analíticas destinadas a la caracterización lipídica y proteica de la leche materna

Resumen

La presente Tesis Doctoral contempla dos grandes líneas de actuación: (i) el desarrollo de métodos rápidos y sencillos de caracterización de la fracción lipídica de la leche materna, con el fin de estudiar su perfil y evolución a lo largo de la lactancia; y (ii) el desarrollo de metodologías por electroforesis en gel, electroforesis capilar (capillary electrophoresis, CE) y cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid chromatography, HPLC), con detección UV-visible y por espectrometría de masas (mass spectrometry, MS), con objeto de evaluar las proteínas lácteas de las muestras o los péptidos resultantes de la digestión de éstas. Para la consecución de los objetivos (i) y (ii) se ha considerado la experiencia previa del grupo en técnicas cromatográficas y de electroseparación capilar y, más en concreto, en el diseño y desarrollo de soportes poliméricos para técnicas de separación miniaturizadas. Cabe destacar que esta Tesis supone el primer contacto del grupo de investigación con muestras de leche materna. Debido a la complejidad de la matriz y considerando la potencial aportación que por parte del grupo podía hacerse, los esfuerzos de esta Tesis han ido principalmente dirigidos a la simplificación o facilitación de la etapa de tratamiento de muestra, atendiendo a la problemática existente a este fin. Así pues, se ha abordado la separación, aislamiento y preconcentración de los diferentes compuestos de interés atendiendo a su diferente naturaleza y, en el caso concreto de los fosfolípidos, incluso desde diferentes perspectivas. Estructura La presente memoria se divide en tres grandes bloques. El primer bloque es introductorio, haciéndose una descripción general de la composición de la leche materna y entrando más en detalle en aquellas fracciones que han sido objeto de análisis de la Tesis (Capítulo 1). A continuación, en el Capítulo 2, se recogen las principales metodologías analíticas que se han empleado para abordar el tratamiento de muestra y análisis de los dos grandes grupos de compuestos estudiados en esta Tesis: lípidos y proteínas. El capítulo se inicia con la extracción de la fracción lipídica y su posterior caracterización, para abordar posteriormente la fracción proteica y las metodologías asociadas a ésta. Por último, en el Capítulo 3, se muestra una visión general de las distintas estrategias utilizadas en la preparación de sorbentes en técnicas de preparación de muestra, en concreto extracción en fase sólida (solid-phase extraction, SPE), centrándose en aquellos materiales que han sido objeto de estudio en esta Tesis: la sílice mesoporosa, los polímeros orgánicos modificados con nanopartículas (nanoparticle, NP) metálicas u óxidos metálicos y los polímeros de impronta molecular (molecularly imprinted polymer, MIP). El segundo bloque engloba los Capítulos 4-7 y está dedicado al análisis de la fracción lipídica de la leche materna. El primer capítulo de este bloque se centra en el análisis del componente mayoritario de la grasa, esto es, los triglicéridos (triacylglycerol, TAG). Para ello, y tras proponer un método de extracción de la grasa a escala reducida, se lleva a cabo un análisis del perfil de TAG de la leche materna y se estudia la posibilidad de distinguir el origen animal de la leche en función de éste aplicando una herramienta quimiométrica de análisis, en concreto, análisis discriminante lineal (linear discriminant analysis, LDA). Por otra parte, los capítulos sucesivos del bloque se centran en el aislamiento y análisis de uno de los componentes minoritarios de la leche, en concreto, los fosfolípidos. Para ello, se han puesto a punto nuevos sorbentes para su uso en SPE, basados en materiales porosos de diferente naturaleza: sílice mesoporosa, monolitos poliméricos de metacrilato de glicidilo (GMA) y posteriormente modificados con NP de magnetita; y MIP. Por su parte, el tercer bloque abarca los Capítulos 8 y 9 y está enfocado hacia el análisis de la fracción proteica de la leche materna y, más concretamente, a la problemática asociada a la separación de los dos grandes grupos de proteínas presentes en la leche: las caseínas (casein, CN) y las proteínas del suero. Dicha problemática se aborda desde dos perspectivas. Por una parte, se propone el empleo de monolitos poliméricos basados en GMA y posteriormente modificados con NP oro (AuNP) para su uso como sorbente en SPE. Por otra parte, se plantea la posibilidad de fraccionar ambos grupos de proteínas por una simple co-precipitación de las CN por la adición de iones calcio y fosfato a la leche con objeto de mejorar el rendimiento de extracción de ambas fracciones respecto al procedimiento clásico de precipitación isoeléctrica. Resultados y conclusiones A continuación, se describen los principales resultados obtenidos y conclusiones derivadas para cada uno de los trabajos incluidos en la Tesis Doctoral. Los trabajos han sido divididos en dos grandes grupos (A y B), correspondientes a los bloques II y III de la memoria, donde se indica de forma desglosada por capítulos (cada capítulo corresponde a una publicación) la metodología adoptada en cada uno de ellos para alcanzar los objetivos planteados, así como los resultados y conclusiones más relevantes obtenidos de los mismos.   A. Análisis de la fracción lipídica de la leche materna A.1. Análisis de triglicéridos En este trabajo (Capítulo 4 de la memoria) se llevó a cabo la separación de TAG presentes en la leche materna y en la leche de otros mamíferos por HPLC en fase reversa empleando una columna particulada de “corazón fundido” (fused core) con detector UV-vis y detector evaporativo de dispersión de luz (evaporative light scattering detector, ELSD). Para la separación cromatográfica se emplearon primeramente mezclas binarias de acetonitrilo (ACN) con diferentes alcoholes (2-propanol, n-butanol and n-pentanol). De entre estos, el n-pentanol proporcionó los mejores resultados en cuanto a resolución y tiempo de análisis. Una vez establecido el gradiente de ACN/n-pentanol, se estudió el efecto de la temperatura y el caudal, seleccionándose unos valores de 10 ºC y 1 mL/min, respectivamente. Bajo las condiciones establecidas, se obtuvo un perfil de TAG donde se resolvieron de manera satisfactoria más de 50 TAG. La identificación de los picos se llevó a cabo por MS con ionización química a presión atmosférica, en la que se observó un pico molecular, la intensidad del cual dependía del grado de insaturación de la molécula de TAG, y los iones resultantes de la pérdida de las cadenas de ácidos grasos, es decir, los diglicéridos. También, se puso a punto un método extracción a escala reducida, el cual requiere unos volúmenes de reactivos y muestra inferiores al método tradicional. El método propuesto se comparó con el método tradicional en lo que al contenido total de grasa y TAG se refiere. Para la cuantificación de los TAG se llevó a cabo una calibración externa con estándares de TAG homogéneos (los tres ácidos grasos unidos a la molécula de glicerol son iguales), estableciéndose unos factores de respuesta relativos comprendidos entre 0.85-1.05. Esto permitió llevar a cabo una estimación del contenido de cada uno de los TAG en base al área de pico del cromatograma. Los resultados obtenidos por ambos métodos no presentaron diferencias significativas. Además, cabe destacar que el método de tratamiento de muestra propuesto no sólo implica una reducción en la cantidad de reactivos necesaria, sino que, debido a la sencillez asociada a la manipulación del material requerido, permite el procesamiento de un mayor número de muestras en comparación con el método tradicional. Por último, se llevó a cabo un estudio estadístico mediante un LDA en base a la composición de TAG de la leche de diferentes mamíferos (humana, bovina, ovina y caprina). Para ello, se seleccionaron 22 TAG comunes a todas las leches consideradas y a partir de las variables normalizadas, usadas como predictores del modelo, se obtuvo la matriz de objetos y se establecieron los conjuntos de entrenamiento y evaluación del modelo. El modelo resultante proporcionó una excelente resolución entre todas las categorías y el conjunto de evaluación fue correctamente clasificado. Esto demostró que es posible diferenciar el origen animal de la leche en base al perfil de TAG obtenido por HPLC-ELSD, lo cual puede resultar de utilidad no solo en estudios centrados en la leche materna, sino también en aquellos basados en productos derivados de la leche de otros mamíferos. Los resultados de este trabajo se encuentran publicados en: I. Ten-Doménech, E. Beltrán-Iturat, J.M. Herrero-Martínez, J.V. Sancho-Llopis, E.F. Simó-Alfonso, Triacylglycerol analysis in human milk and other mammalian species: small-scale sample preparation, characterization, and statistical classification using HPLC-ELSD profiles, J. Agric. Food Chem. 63 (2015) 5761–5770. doi:10.1021/acs.jafc.5b01158. A.2. Análisis de fosfolípidos En estos trabajos (Capítulos 5, 6, y 7 de la memoria) se evaluaron diferentes materiales porosos como sorbentes de extracción en fase sólida (solid-phase extraction, SPE) para el aislamiento de fosfolípidos (phospholipid, PL) empleando fosfatidilcolina (phosphatidylcholine, PC) como soluto test. De entre los materiales seleccionados se encuentran los de sílice, dos de ellos mesoporosos (UVM-7 y MCM-41) y otro comercial (Capítulo 5), un monolito polimérico de GMA modificado con NP de magnetita (Capítulo 6), y otro basado en la tecnología de impronta molecular (Capítulo 7). Tras la síntesis de los materiales, se llevó a cabo su caracterización morfológica empleando microscopía electrónica de barrido (scanning electronic microscopy, SEM) y transmisión (transmission electronic microscopy, TEM) así como medidas del área superficial y el tamaño de poro. Asimismo, se abordó el mecanismo de interacción entre el analito de interés y los diferentes sorbentes. En lo que respecta a la SPE, se investigaron diferentes parámetros experimentales que afectan el proceso, como p.ej. el disolvente de carga y elución, el volumen de ruptura, la capacidad de carga y la reutilización. Para la evaluación de las recuperaciones en las diferentes variables estudiadas, se empleó un ensayo colorimétrico basado en la formación del complejo PL ferrotiocianato de amonio. El protocolo de SPE desarrollado se aplicó satisfactoriamente a extractos de grasa de leche materna, observándose una notoria preconcentración de los analitos de interés y eliminación de lípidos no polares (TAG). Los PL extraídos fueron analizados mediante cromatografía líquida de interacción hidrofílica (hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC) acoplada a ELSD. Para ello se empleó una fase móvil a partir de mezclas de ACN-formiato amónico y agua-formiato amónico a una temperatura de 25 ºC y un caudal de 1 mL/min. También, se realizaron curvas de calibrado (externa y de adición estándar) de los PL, descartándose el posible efecto matriz (a partir de los resultados obtenidos). En el caso de los materiales de sílice mesoporosa (mesoporous silica material, MSM) (Capítulo 5), los cuales se caracterizan por su elevada área superficial (>1000 m2/g), su gran volumen de poro (>1 cm3/g) y su fácil manipulación, se sintetizaron el material MCM-41 y los materiales UVM-7 puro y dopado con titanio. La síntesis de estos últimos se llevó a cabo siguiendo la ruta del complejo de atrano (o silatrano en este caso) como precursor inorgánico, y el surfactante bromuro de cetiltrimetilamonio como plantilla y especie porógena. La eliminación del surfactante de los materiales sintetizados se llevó a cabo por dos vías: calcinación y extracción química con una mezcla ácido acético/etanol (EtOH). Como resultado, se obtuvo el material UVM-7, el cual puede describirse como un sistema de poros bimodal que contiene mesoporos intra-particulares y macroporos inter-particulares. Una vez obtenidos los materiales, se empaquetaron 10 mg de cada uno de estos en los correspondientes cartuchos de SPE. Dentro del protocolo SPE, se estableció en primer lugar el disolvente o mezcla de disolventes más adecuado para la elución, obteniéndose los mejores resultados para la mezcla CHCl3:metanol (MeOH):H2O (3:5:2, v/v/v). Como disolventes de carga, se trabajó con una mezcla de hexano:EtOH (98:2, v/v) y con la mezcla CHCl3:MeOH (2:1, v/v), proporcionando la primera de éstas los mejores resultados. En lo que respecta al mecanismo de interacción entre el soluto test (PC) y los materiales de sílice, cabe destacar que, bajo las condiciones experimentales escogidas, las moléculas de PC se encuentran agregadas en forma de micelas invertidas, por lo que se propuso un mecanismo de interacción soluto-sorbente basado en dos pasos: (i) difusión de las micelas invertidas de PC a lo largo del sistema de poros de la sílice; y (ii) ruptura de las micelas de PC inducida por la interacción favorable con los grupos silanol de la superficie de la sílice (Si-OH···PC). De entre los materiales testados, incluyendo el de sílice comercial (SupelCleanTM), el material UVM-7, en el que los restos de surfactante de la síntesis habían sido retirados por extracción química (UVM-7-Ext), proporcionó los mejores resultados. Este hecho, se atribuyó al entorno más hidrofílico (mayor proporción de grupos silanoles) del material UVM-7-Ext con respecto al MCM-41 y SupelCleanTM, junto con el segundo sistema de poros bimodal característico del material UVM-7. Cabe destacar que, el material UVM-7 dopado con Ti no proporcionó los resultados esperados, ya que la interacción del Ti con los grupos fosfato de los PL no exaltó las prestaciones del material. Este hecho se atribuyó, bien a la baja disponibilidad del Ti en la superficie de los poros, ya que la mayoría de éste queda embebido dentro de las paredes del material; o bien cambios en la estructura y reducción del tamaño de poro y área superficial asociados a la introducción de Ti en la sílice. En cualquier caso, el material UVM-7-Ext proporcionó una elevada capacidad de adsorción (544 µg de PC por mg de sorbente), reutilización (más de 15 usos) y capacidad de preconcentración (hasta 16 veces). En lo referente al material polimérico de GMA modificado con NP de magnetita (Capítulo 6), en primer lugar, se sintetizaron las NP por el método de co-precipitación de disoluciones acuosas de Fe3+ y Fe2+ en medio básico, obteniéndose unas NP magnéticas (magnetic nanoparticle, MNP) de un tamaño promedio de 12 nm (medido por TEM). Por otra parte, se sintetizó el material polimérico de GMA y dimetacrilato de etilenglicol (ethylendimethacrylate, EDMA), se trituró con un mortero y se tamizó hasta un tamaño de partícula de entre 125 y 200 µm. Seguidamente, el material de GMA-co-EDMA se silanizó y sobre éste se anclaron las MNP. La caracterización morfológica del material por SEM mostró claramente el anclaje de la magnetita sobre la superficie de éste. Por otra parte, se evaluó el contenido de hierro (previa calcinación del material) por UV-Vis y por plasma acoplado inductivamente-MS previa calcinación, obteniéndose un 1.6-1.7% de Fe (m/m). Asimismo, las isotermas de adsorción-desorción de nitrógeno empleando el modelo Brauner-Emmet-Teller (BET) mostraron que la incorporación de MNP supuso un incremento del área superficial (15.17 m2/g) respecto al polímero sin modificar (6.14 m2/g), lo cual contribuye a exaltar la retención de los analitos de interés. En este trabajo, debido a las propiedades magnéticas del sorbente, el proceso de extracción se abordó de dos maneras distintas: (i) en cartuchos de SPE en los que se empaquetaron 150 mg de sorbente; y (ii) en modalidad dispersiva, también conocida como extracción en fase sólida magnética (magnetic solid-phase extraction, MSPE), empleando también 150 mg de sorbente. En primer lugar, se estudió el disolvente de carga, ensayándose las mezclas CHCl3:MeOH (2:1, v/v) y hexano:EtOH (98:2, v/v), obteniéndose una retención sobre el sorbente del 45 y 97%, respectivamente. Estos resultados pueden explicarse teniendo en consideración el proceso de adsorción de los PL sobre la superficie de las MNP, en el cual intervienen dos fuerzas impulsoras: (i) un aumento de la entropía debido al desplazamiento de las moléculas de disolvente alrededor de las NP por las moléculas de PL; o (ii) la atracción carga-dipolo entre la superficie cargada de las NP y el dipolo P N de las cabezas de PL. Así pues, los resultados sugirieron que, con disolventes más polares, las MNP así como la PC se encontraban preferentemente solvatadas, lo cual va en detrimento de su interacción y, por ende, de la adsorción de PC sobre las MNP. Una vez establecido el disolvente de carga, la PC retenida se desorbió con la mezcla CHCl3:MeOH (2:1, v/v). En las condiciones de carga y elución establecidas, la capacidad de adsorción del sorbente en SPE fue superior (5.7 µg de PC por mg de sorbente) a la mostrada en dispersiva (MSPE) (3.3 µg de PC por mg de sorbente). Además, la reutilización de los cartuchos de SPE fue claramente superior (10 usos) a la mostrada en MSPE (un único uso), debido, entre otros aspectos, a la pérdida de material magnético tras el proceso de regeneración de éste. En lo que respecta a los MIP (Capítulo 7), se llevó a cabo en primer lugar un estudio de pre-polimerización por espectroscopía infrarroja, en el que se estudiaron las interacciones moleculares entre la molécula plantilla (template, T) (PC) y el monómero funcional (functional monomer, M) (ácido metacrílico) en diferentes disolventes (ACN, MeOH y tetrahidrofurano). En base a esto, se seleccionó ACN como disolvente para la síntesis de los MIP. A continuación, se sintetizaron varios MIP, estudiándose la influencia de la relación molar T:M: agente entrecruzante (cross-linker, C) y porcentaje de iniciador radicalario. Tras su trituración y tamizado (tamaño de partícula <100 nm), 25 mg de cada MIP, y su correspondiente polímero sin T, se empaquetaron en sendos cartuchos de SPE. Se consideraron como disolventes de carga las mezclas CHCl3:MeOH (2:1, v/v) y hexano:EtOH (98:2, v/v), siendo esta última la seleccionada finalmente; y como disolvente de elución la mezcla CHCl3:MeOH (2:1, v/v). De entre los MIP sintetizados, el MIP con una relación T:M:C de 1:6:30 y un 4.2% de iniciador mostró la mejor habilidad de reconocimiento por la molécula plantilla. Seguidamente, se investigó la selectividad del MIP frente a otros PL, observándose que éste mostraba una elevada afinidad no solo por la PC, sino por otros PL como la esfingomielina y la fosfatidiletanolamina. Este fenómeno, conocido como “reactividad cruzada”, es de gran utilidad para el fin que se perseguía en el trabajo: la extracción del conjunto de PL. Asimismo, el MIP mostró una buena capacidad de carga (41 μg PC por mg de sorbente) y una reutilización de al menos 20 veces para disoluciones patrón de PC y de al menos 6 veces para extractos de grasa de leche materna. Cabe destacar que, todos los sorbentes desarrollados y empleados en los Capítulos 5-7 suponen un ayuda adicional a la hora de preservar la integridad de la columna cromatográfica ya que, pese a que existen estudios que llevan el análisis de PL sin previa preconcentración, la etapa previa de aislamiento de PL de los extractos de grasa supone una disminución notable en el contenido de lípidos no polares (TAG) y, por consiguiente, en el frente de elución. Por otra parte, cada uno de estos trabajos representa la primera aplicación del correspondiente material a la preconcentración de PL en matrices complejas. Los resultados de estos trabajos se encuentran publicados en: H. Martínez Pérez-Cejuela, I. Ten-Doménech, J. El Haskouri, P. Amorós, E.F. Simó-Alfonso, J.M. Herrero-Martínez, Solid-phase extraction of phospholipids using mesoporous silica nanoparticles: application to human milk samples, Anal. Bioanal. Chem. 410 (2018) 4847–4854. doi:10.1007/s00216-018-1121-8. I. Ten-Doménech, H. Martínez-Pérez-Cejuela, E.F. Simó-Alfonso, S. Torres-Cartas, S. Meseguer-Lloret, J.M. Herrero-Martínez, Polymer-based materials modified with magnetite nanoparticles for enrichment of phospholipids, Talanta 180 (2018) 162–167. doi:10.1016/j.talanta.2017.12.042. I. Ten-Doménech, H. Martínez-Pérez-Cejuela, M.J. Lerma-García, E.F. Simó-Alfonso, J.M. Herrero-Martínez, Molecularly imprinted polymers for selective solid-phase extraction of phospholipids from human milk samples, Microchim. Acta 184 (2017) 3389–3397. doi:10.1007/s00604-017-2345-6. B. Análisis de la fracción proteica de la leche materna En este trabajo (Capítulo 8) se describe un método para el aislamiento de las proteínas del suero de la leche materna mediante SPE empleando un material polimérico modificado con AuNP. En primer lugar, se procedió a la síntesis del polímero de GMA, se trituró posteriormente con un mortero y se tamizó hasta un tamaño de partícula de entre 100 y 200 µm. A continuación, se llevó a cabo la modificación de su superficie mediante reacción con amoníaco, seguida de la posterior inmovilización de las AuNP en su superficie. El contenido de Au, medido colorimétricamente previa calcinación del material, fue de un 1.3% m/m. Asimismo, las micrografías SEM mostraron la presencia de las AuNP en la superficie del sorbente. Dada la elevada afinidad que se esperaba de este material por los grupos tiol y amino, habitualmente presentes en biomoléculas como las proteínas, se decidió aplicarlo al aislamiento de éstas. Así pues, se empaquetaron 50 mg del material sintetizado, y se seleccionaron una serie de proteínas séricas como son la albúmina sérica humana (HSA), la α-lactoalbúmina (α-La), la lactoferrina (Lf) y la lisozima (Lyz). Se investigaron diferentes variables (pH, fuerza iónica) con el fin de conseguir el máximo rendimiento en el proceso de extracción. El sorbente mostró una elevada retención (>80%) por las proteínas ácidas (HSA y α-La) a lo largo de un amplio rango de pH (3.0-9.0); mientras que para las proteínas más básicas (Lf y Lyz), las mayores retenciones se encontraron para valores de pH próximos al pI de éstas. A la vista de los resultados, se concluyó que existían diferentes mecanismos responsables de la interacción entre las proteínas y las AuNP. Por una parte, la presencia de interacciones electrostáticas entre los grupos citrato (estabilizadores de las AuNP) con dominios cargados positivamente de las proteínas, independientemente de la carga global de éstas. Por otra, también era de esperar un mecanismo de desplazamiento o de reordenamiento de la estructura de la proteína como consecuencia de su adsorción sobre la superficie, ya que a un pH próximo al pI las interacciones electrostáticas proteína-sorbente se verían minimizadas. Bajo las mejores condiciones establecidas (pH de carga 5.0, pH de elución 12 con 0.25 M de NaCl) el sorbente SPE proporcionó excelentes recuperaciones, ofreciendo una alta permeabilidad y reutilización (más de 20 veces). Cabe destacar que, este trabajo representa la primera aproximación centrada en la interacción de AuNP inmovilizadas sobre soportes poliméricos y las proteínas presentes en la leche, para el empleo de este tipo de materiales como sorbente de extracción en SPE. Asimismo, la viabilidad de la metodología propuesta, seguida por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (sodium docecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE), quedó satisfactoriamente demostrada con el aislamiento de las proteínas de interés tanto de extractos de suero de leche materna, como directamente de muestras de leche diluidas, es decir, sin haber llevado a cabo previamente la precipitación isoeléctrica de las CN. En el estudio del Capítulo 9 se describe un método sencillo de tratamiento de muestra para el fraccionamiento efectivo de las proteínas de la leche materna en sus dos grupos principales: suero y CN. El protocolo de extracción consistió en la adición de iones calcio y fosfato a la leche sin ajuste previo de pH, seguido etapas de lavado y centrifugación. La combinación de ambos iones dio lugar a la precipitación de fosfato cálcico y como resultado, a una co-precipitación efectiva de las CN. Este hecho se atribuyó principalmente a que, en la leche, el fosfato inorgánico (o fosfato cálcico coloidal) y el fosfato orgánico (esterificado en la caseína a través del grupo hidroxilo del aminoácido serina) se encuentran asociados químicamente. Por otra parte, se estudió el efecto de la adición a la leche de cada uno de estos iones por separado, observándose que ambos iones eran partícipes y necesarios en el proceso de fraccionamiento. La efectividad del fraccionamiento por co-precipitación, así como por precipitación en el punto isoeléctrico (método tradicional) se siguió por SDS-PAGE, por nano-LC-MS/MS, previa digestión de las proteínas con tripsina, y por CE. Los resultados obtenidos mostraron que, la precipitación con iones calcio y fosfato, producía una disminución significativa en la contaminación de la fracción de CN con proteínas del suero y viceversa, comparado con el método convencional de precipitación de CN. En lo referente al análisis de la leche materna por CE, se empleó un tampón isoeléctrico constituido por urea, hidroxietilcelulosa y ácido iminodiacético (pH aparente 3.1), obteniéndose un perfil electroforético en el que las principales proteínas del suero y CN se encontraban adecuadamente resueltas en un tiempo de análisis breve. Además, se aplicó satisfactoriamente la recolección de fracciones en CE acoplada a LC-MS/MS (acoplamiento fuera de línea) para la identificación de proteínas minoritarias en esta matriz compleja. Esta combinación permitió identificar proteínas tales como inmunoglobulinas, las cuales no han sido identificadas previamente mediante esta técnica separativa. Por otra parte, se llevó a cabo una clasificación de todas las proteínas identificadas en la recolección (en total 62) de acuerdo con su función molecular, el proceso biológico en el que se encuentran involucradas y su localización en los diferentes componentes celulares. Cabe destacar que, en lo que respecta a reactivos, instrumentación y esfuerzo, la metodología de fraccionamiento propuesta supone una aproximación de bajo coste y gran alcance para cualquiera que sea el fin que se persiga (p. ej. diferencias en el perfil electroforético de la leche materna según la etapa de lactancia o selección de biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades). Así pues, la metodología planteada en este trabajo constituye una herramienta prometedora para acrecentar el conocimiento del proteoma de la leche materna. Los datos obtenidos en este trabajo se encuentran disponibles en el consorcio ProteomeXchange con el identificador PXD010315. Los resultados de estos trabajos se encuentran publicados en: I. Ten-Doménech, E.F. Simó-Alfonso, J.M. Herrero-Martínez, Isolation of human milk whey proteins by solid phase extraction with a polymeric material modified with gold nanoparticles, Microchem. J. 133 (2017) 320–326. doi:10.1016/j.microc.2017.03.058. I. Ten-Doménech, E.F. Simó-Alfonso, J.M. Herrero-Martínez, Improving fractionation of human milk proteins through calcium phosphate coprecipitation and their rapid characterization by capillary electrophoresis, J. Proteome Res. 17 (2018) 3557-3564. doi:10.1021/acs.jproteome.8b00526.