Estudio funcional de polimorfismos de la vía de activación de la proteína c

Resumen

INTRODUCCIÓN La trombosis venosa es una enfermedad multifactorial, originada por una suma de factores endógenos que predisponen al evento trombótico bajo la influencia de una exposición a factores exógenos (1-7). Dicha predisposición engloba factores de riesgo adquiridos que provocan en el individuo una disminución de su capacidad para enfrentarse a las alteraciones normales de la hemostasia, producto de la edad, dislipemias, diabetes, embarazo o puerperio, inmovilizaciones, intervenciones quirúrgicas, uso de píldoras anticonceptivas, tratamientos hormonales, etc. Además, se han identificado diferentes factores de riesgo genéticos, tales como las mutaciones factor V Leiden y protrombina G20210A, y el déficit de diversas proteínas con función anticoagulante, como es el déficit de antitrombina (AT), proteína C (PC), proteína S (PS), hiperhomocisteinemia, disfibrinogenemias e hipo- ó displasminogenemias (8-15), que aumentan en mayor o menor medida el riesgo de trombosis. Sin embargo, todas estas deficiencias, por sí solas, no consiguen explicar más que alrededor de un 50% de los casos de trombosis, de forma que es posible la existencia de mutaciones o alteraciones en alguno de los componentes del sistema hemostático todavía desconocidos, que por sí solas o sumadas a otras alteraciones, nos permitan explicar mejor el evento trombótico. El sistema de la proteína C (PC) es esencial para la regulación de la coagulación y para la prevención de trombosis venosas y arteriales. De hecho, casi la mitad de todas las causas conocidas de trombofilia están asociadas a una alteración hereditaria o adquirida de la vía de la proteína C tales como deficiencias de PC, proteína S (PS) o resistencia a la proteína C activada (APC) (16-18). La vía de la PC se inicia cuando la trombina se une a su receptor localizado en la superficie de la célula endotelial, denominado trombomodulina. El complejo trombina-trombomodulina (T-TM) activa a la PC. La PC activada (APC), junto con su cofactor la proteína S, limita la amplificación y progresión de la cascada de la coagulación al inhibir proteolíticamente a los cofactores de la coagulación Va y VIIIa. Además, otro receptor, el receptor endotelial de la PC (EPCR), acelera la activación de la PC por el complejo T-TM (19,20). El EPCR (21-24) es una proteína transmembrana tipo I, que se expresa principalmente en el endotelio de los grandes vasos. La unión de la PC al EPCR estimula la activación de la PC por el complejo trombina-TM. La molécula de EPCR es similar a la del complejo mayor de histocompatibilidad tipo I, en particular a la subfamilia CD1. Además de los dominios α1 y α2 extracelulares, el EPCR tiene un dominio transmembrana y una cola citoplasmática corta. Esta cola citoplasmática, mediante corte proteolítico por una metaloproteasa, es liberada al plasma, generando una molécula de EPCR soluble (sEPCR), con afinidad tanto por PC como APC. El gen del EPCR se expande a lo largo de 6Kb, está localizado en el cromosoma 20q11.2 y consta de 4 exones. El exón 1 (aminoácidos 1 a 24) codifica para la región 5´ no traducida (5´UTR), el péptido señal y otros 7 residuos. Los exones 2 y 3 (aminoácidos 24 a 108 y 108 a 201) codifican para la mayor parte de la región extracelular. El exón 4 (aminoácidos 201 a 238) codifica para 10 residuos de la región extracelular, el dominio transmembrana y la región 3´ no traducida (3´UTR). Se han identificado 4 haplotipos en el gen del EPCR: H1, H2, H3 y H4, de los cuales 3 contienen uno ó más polimorfismos (SNPs) específicos de haplotipo (25-30): - El haplotipo 1, cuyo polimorfismo marcador es el g.4678G>C de la región 3´UTR, está asociado con un aumento en los niveles de APC y una disminución del riesgo de TEV. De forma, que se ha observado que los portadores del genotipo 4678CC tienen casi 3 veces menor riesgo de TEV. - El haplotipo 2, contiene los alelos comunes de todos los SNPs del gen. - El haplotipo 3, cuyo polimorfismo marcador es el g.4600A>G en el exón 4 y que da lugar al cambio de aminoácido Ser a Gly en posición 219 (p.Ser219Gly). Está asociado con niveles aumentados de sEPCR, pero su asociación con el TEV es controvertida, existiendo resultados contradictorios según el trabajo. - El haplotipo 4, cuyo polimorfismo marcador es el g.3810G>A en el intrón 2, parece causar un ligero aumento del riesgo de TEV. Sin embargo, y por el momento, no se conoce cuál de los SNPs localizados en cada haplotipo son los responsables de los efectos observados. La TM (31) posee un papel anticoagulante, vía formación del complejo trombina-TM, que acelera la activación de la proteína C. Se han descrito diferentes mutaciones en el gen de la TM, algunas de las cuales han sido asociadas con la trombosis venosa y/o arterial (32-35). El polimorfismo g.1418C>T del gen de la TM (33) da lugar al cambio de aminoácido de Ala a Val en el residuo 455 de la proteína (p.Ala455Val) y está localizado en el sexto dominio tipo EGF contiguo al sitio de unión a la trombina, región que interviene en la interacción con la proteína C, y por tanto sugiere un posible papel modulador en la activación de la proteína C. Sin embargo, se han descrito resultados contradictorios respecto a la asociación de este polimorfismo con la trombosis venosa (36-39). Existe una forma soluble de TM circulante en plasma (sTM) (40), como consecuencia de la proteolisis y liberación de la superficie endotelial donde ejerce su acción, y cuya concentración aumenta en ciertas patologías asociadas a disfunción endotelial. Dado que estos dos receptores endoteliales son esenciales para la activación de la proteína C y consiguiente generación de APC, cualquier alteración disfuncional de los mismos puede reducir la generación de APC circulante. Puesto que una reducción de APC en la circulación es un riesgo independiente de trombosis venosa y arterial (41-43), el estudio funcional de los polimorfismos de estos dos receptores resulta esencial. OBJETIVOS 1.- Analizar la influencia de los haplotipos H1 y H3 sobre la expresión del gen EPCR, utilizando dos estrategias diferentes. Por una parte, se clonarán los intrones 1 y 2 del EPCR (que contienen 8 de los 10 SNPs característicos del H1) en la posición del primer intrón del cDNA de la luciferasa, y la región 3’UTR del EPCR (que contiene los otros dos SNPs) detrás del cDNA de la luciferasa. Los insertos provendrán de portadores de haplotipos H1 ó H2, este último como control ya que contiene la forma alélica común de los 10 SNPs. Estas construcciones se transfectarán en la línea celular endotelial ECRF24 y en células HepG2, utilizando una construcción de luciferasa de Renilla para corregir la eficiencia de transfección. Una vez identifiquemos cuál de las tres regiones del EPCR clonadas es responsable del efecto observado en el haplotipo H1, procederemos a clonar uno a uno los polimorfismos por separado incluidos en dicha región, para establecer cuál de ellos es el funcional. Por otra parte, realizaremos estudios funcionales en cultivos de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) de unos 100 cordones (HUVECs), que expresan EPCR. Aislaremos el DNA y mRNA de dichas células para su genotipado y cuantificación de la expresión génica en función de su genotipo. También cuantificaremos el EPCR antigénico tanto en el sobrenadante del cultivo celular (equiparable a la concentración de sEPCR en plasma), como en el extracto de membrana celular (equiparable a la concentración de EPCR en la pared vascular). 2.- Analizar la influencia del polimorfismo g.1418C>T sobre la expresión del gen TM. Para ello, cuantificaremos el mRNA y proteína en los cultivos de HUVEC indicados anteriormente (que también expresan TM) con el fin de comparar la expresión de TM de acuerdo con el genotipo del polimorfismo g.1418C>T, para establecer si dicho polimorfismo es funcional. También realizaremos un estudio caso-control con 1.000 pacientes con TEV y 1.000 controles, en el que valoraremos la asociación genotipo (g.1418C>T)-fenotipo (concentración de sTM y de APC en plasma)-enfermedad (TEV). METODOLOGÍA Pacientes y controles El estudio incluirá unos 1.000 pacientes con historia de TEV confirmado objetivamente mediante niveles de dímeros-D, ultrasonografía de compresión, gammagrafía pulmonar de ventilación/perfusión y, si fuera necesario, flebografía o angiografía pulmonar. Los pacientes ya están reclutados, y proceden de tres hospitales Españoles. Un grupo de unos 1.000 sujetos aparentemente sanos y sin historia personal o familiar de trombosis será el grupo control. Todos los individuos han dado su consentimiento informado para participar en el estudio, y éste ha sido aprobado por el Comité Ético de nuestro hospital, y seguirá las líneas establecidas en el acuerdo de Helsinki enmendadas en Edinburgo en 2000. Métodos Los niveles de EPCR y TM en plasma y en los cultivos de HUVECs se determinarán con ELISAs específicos (Diagnostica Stago, Asniéres-sur-Seine, Francia). Los niveles circulantes de APC se determinarán por un ensayo desarrollado por nuestro grupo (25,41). Los cultivos de HUVECs se realizarán como se describió anteriormente (44). Brevemente, las HUVECs se obtendrán por digestión con colagenasa y serán cultivadas hasta su confluencia en frascos T-75 recubiertos con factor de adhesión de células endoteliales (Sigma-Aldrich Co, Alemania) en medio 199 con 15 mM HEPES, suplementado con suero bovino fetal al 20%, factor de crecimiento celular endotelial al 1%, L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, 50 U/mL de penicilina, y 50 µg/mL de sulfato de estreptomicina en una atmósfera de 95%/5% aire/CO2. Una vez confluentes, las HUVECs se aislarán por digestión con tripsina. Para el aislamiento y cuantificación del ARNm, las células se almacenarán a -75ºC después de añadir 5 volúmenes de RNAlater (Ambion, Austin, TX, USA). Para la determinación de EPCR y TM en el sobrenadante del cultivo y en el lisado celular, una vez confluentes, las células se incubarán durante 3 horas con medio 199 suplementado con suero bovino fetal al 2% y sulfato de estreptomicina. Después, el sobrenadante se guardará a -75ºC hasta su uso para cuantificar la concentración de sEPCR y sTM liberados. Para la medida del EPCR y TM unidos a la membrana, las células se lavarán tres veces y se disgregarán con tres ciclos de congelación/descongelación en nitrógeno líquido. A continuación se incubarán durante 2 h a 4ºC con 50 μl/pocillo de PBS pH 7,5, conteniendo 1% de Tritón X-100, 5 mM EDTA, y 1 mM fenilmetilsulfonil-fluoruro, en agitación constante. La proteína total en el lisado se medirá con el ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL). Los valores de la fracción lisada se darán como ng EPCR ó TM/mg proteína total. El ADN genómico se aislará de las HUVECs con el kit Wizard Genomic DNA purification (Promega, Madison, WI, USA), según las indicaciones del fabricante. Los haplotipos H1 y H3 del EPCR se analizarán como se describió anteriormente (25). El polimorfismo c.1418C>T del TM se analizará por secuenciación directa con el ABI PRISM® 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA), utilizando una serie de cebadores diseñados para esta región: directo 5´-GTGGCTTCGAGTGCCACTGC-3´ y reverso 5´-CGCACTTGTACTCCATCTTGGCCCTG-3´. El ARNm se aislará de las HUVEC utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizará mediante transcripción reversa de 1 µg de ARNm total usando el sistema SuperScript III Synthesis System (Invitrogen). El ADNc se guardará a -20ºC. La cuantificación del ARNm del EPCR y TM se llevará a cabo con cebadores adecuados y siguiendo el protocolo indicado previamente (45). BIBLIOGRAFÍA 1. Mannucci PM, Tripodi A. 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