Impact of pharmacological and environmental manipulations on neuronal structural plasticity and dynamics

Resumen

INTRODUCCIÓN El sistema nervioso de vertebrados es uno de los más estudiados, aunque peor comprendidos, del organismo de mamíferos. Desde que Ramón y Cajal postuló su teoría celular de este sistema (Ramón y Cajal, 1909), la neurona se ha postulado como su unidad funcional. Sin embargo, durante las últimas décadas se ha revolucionado la visión que se tenía de éste. Una de las percepciones más asentadas era que, tras el desarrollo embrionario, el sistema nervioso se mantenía inmutable. Sin embargo, ahora sabemos que diferentes formas de plasticidad gobiernan su adaptación, que son necesarias para importantes procesos del día a día, tales como el aprendizaje y la memoria (Berlucchi and Buchtel, 2009; Smythies, 2002) y que se ven afectadas en diferentes trastornos neuropsiquiátricos (Baroncelli et al, 2011; Duman et al, 2000; Flores et al, 2016; Nacher et al, 2013; Shin and Liberzon, 2010). Estos cambios plásticos comprenden diferentes procesos, como alteraciones en la estructura de neuronas (plasticidad estructural), y pueden estar modulados por diferentes neurotransmisores, neurotrofinas o moléculas relacionadas con la plasticidad. En la siguiente tesis voy a centrarme en la plasticidad estructural de la neurona y su modulación en diferentes áreas cerebrales: la amígdala, el hipocampo, y dos regiones del neocórtex: las cortezas prefrontal y de barriles. La corteza prefrontal (CPF) es una corteza de asociación, situada en la parte anterior del cerebro de mamíferos. Es responsable de procesos como la motivación, el autoconocimiento, el comportamiento social y la memoria de trabajo, entre otros(Fuster, 2015). Sin embargo, su mal funcionamiento está involucrado en varios trastornos neuropsiquiátricos, que incluyen la esquizofrenia, la depresión severa y los trastornos del espectro autista (Bicks et al, 2015). Por otra parte, la corteza de barriles es una subregión de la corteza somatosensorial primaria, que sólo está presente en algunas especies, principalmente roedores, y que recibe la información desde las vibrisas del animal a través del tálamo. El hipocampo ha sido ampliamente estudiado debido a su papel en la memoria a corto plazo, la consolidación de la memoria a largo plazo y la memoria espacial. Por último, la amígdala, como el hipocampo, forma parte del sistema límbico. Entre sus funciones principales se encuentran el procesamiento de comportamientos aversivos y la motivación y procesamiento de estímulos ambientales gratificantes. Su mal funcionamiento también está relacionado con varios trastornos psiquiátricos, como la esquizofrenia (Aleman and Kahn, 2005) o trastornos relacionados con la ansiedad (Shin and Liberzon, 2010). La neurona como objeto de estudio En la siguiente tesis se han estudiado tanto neuronas piramidales como interneuronas. Las neuronas piramidales son glutamatérgicas y por lo tanto liberan el aminoácido glutamato, el neurotransmisor excitador más común en el encéfalo. Son principalmente neuronas de proyección y son el tipo celular más estudiado en el sistema nervioso central (Kandel et al, 2012). Una de las principales características de las neuronas piramidales es la presencia de espinas dendríticas que son especializaciones membranosas de sus dendritas, cuya función es agrupar los receptores y compartimentar espacialmente la señal eléctrica (Lee et al, 2012). Por otro lado, los axones también muestran varicosidades membranosas, llamadas botones axónicos, que contienen y liberan las vesículas sinápticas. Debido a sus funciones como elementos postsinápticos y presinápticos, las espinas y botones son marcadores apropiados para la inervación y la enervación neuronal, y aumentos de estas estructuras se han correlacionado con los aumentos de la actividad neuronal (Becker et al, 2008; Engert and Bonhoeffer, 1999). Las interneuronas son neuronas inhibidoras en el sistema nervioso central. Su nombre se debe a su papel intermedio en los circuitos neuronales, ya que proyectan localmente, y generalmente, son responsables del correcto funcionamiento de estos circuitos. Al contrario que las neuronas piramidales, las interneuronas forman parte de una población heterogénea con diversas características morfológicas, fisiológicas, neuroquímicas y sinápticas, lo que complica su estudio y comprensión. Como característica unificadora, todas son GABAérgicas, lo que significa que sintetizan y secretan el ácido γ-aminobutírico (GABA), el principal neurotransmisor inhibitorio del encéfalo. También pueden expresar diferentes receptores excitadores e inhibidores en sus dendritas o somas. En esta tesis doctoral, utilizaré la clasificación molecular de la terminología de Petilla (Ascoli et al, 2008) que define cinco tipos de interneuronas dependiendo de la expresión de diferentes proteínas quelantes de Ca2+ y neuropéptidos; estas son: parvalbúmina, somatostatina, neuropéptido Y, péptido intestinal vasoactivo y colecistoquinina. centraren adelante me centraré en las poblaciones de interneuronas que expresan parvalbúmina y somatostatina. En primer lugar, las interneuronas que expresan parvalbúmina pueden subdividirse en 2 subtipos: células en cestos y células en candelabro. En esta tesis se han estudiado únicamente las células en cestos, que reciben su nombre de las cestas perisomáticas que forman alrededor de los somas de las neuronas piramidales. De hecho, esta inhibición perisomática permite que una única célula que expresa parvalbúmina inhiba simultáneamente muchas neuronas piramidales. Este fenómeno produce la sincronización de las células piramidales, importante para el correcto funcionamiento del sistema (Singer, 1999). Debido a eso, las células en cestos son uno de los tipos más estudiados de interneuronas del encéfalo. La otra población de interneuronas estudiado en esta tesis fue la que expresa el neuropéptido somatostatina. Estas interneuronas se encuentran en diferentes zonas del encéfalo, incluyendo el neocórtex (Markram et al, 2004), el hipocampo (Freund and Buzsáki, 1996) y la amígdala (Real et al, 2009). Su morfología es diversa, pero su función es muy específica: inhiben fuertemente la porción distal de dendritas de las neuronas piramidales y frecuentemente reciben inhibición recíproca de otras interneuronas (Urban-Ciecko and Barth, 2016). Son esenciales para la maduración de los circuitos corticales profundos (Tuncdemir et al, 2016) y juegan un papel importante en otras etapas del neurodesarrollo, en diferentes patologías y en la plasticidad neuronal (Liguz-Lecznar et al, 2016). Además, presentan espinas dendríticas, una característica poco común en las interneuronas (Gilabert-Juan et al, 2013b, 2017; Guirado et al, 2014). Plasticidad estructural Las neuronas piramidales y las interneuronas pueden cambiar su morfología en diferentes condiciones, incluyendo cambios en la longitud y complejidad de sus árboles dendríticos, y en la densidad o morfología de sus espinas dendríticas (Fu and Zuo, 2011) y botones axónicos (Colicos et al, 2001; Florence et al, 1998; Nikonenko et al, 2003). Estos cambios ocurren tanto en condiciones naturales (Afroz et al, 2016; Burke and Barnes, 2006; Woolley and McEwen, 1994) como patológicas (Flores et al, 2016; Glausier and Lewis, 2013; McEwen, 1999; Qiao et al, 2016). Entre todos los tipos neuronales, las interneuronas que expresan somatostatina son especialmente interesantes, ya que presentan espinas dendríticas que cambian su número y morfología en animales sometidos a estrés crónico (Gilabert-Juan et al, 2011, 2013b, 2017) o tras la depleción de moléculas relacionadas con la plasticidad (Castillo-Gómez et al, 2016a; Guirado et al, 2014). Por otra parte, en los últimos años han emergido nuevas técnicas que estudian espinas dendríticas o botones axónicos longitudinalmente in vitro o in vivo. Estos métodos nos proporcionan información sobre las dinámicas estructurales de la neurona de interés, y además son sensibles a cambios transitorios y homeostáticos que de otra manera no podrían ser detectados. Se han observado cambios en las dinámicas estructurales de neuronas piramidales durante el envejecimiento cerebral natural (Grillo et al, 2013; Mostany et al, 2013) y después de paradigmas de privación sensorial tanto en circuitos excitadores (Cane et al, 2014; Hofer et al, 2009; Holtmaat and Svoboda, 2009) como inhibidores (Chen et al, 2011b, 2011c, 2012; Chen and Nedivi, 2013; Keck et al, 2011; van Versendaal et al, 2012). Estas formas de plasticidad son moduladas por diferentes sistemas de neurotransmisores, la expresión de moléculas específicas y neurotrofinas. Respecto al primer punto, en la presente tesis me centraré en la modulación por los sistemas de neurotransmisión glutamatérgica, GABAérgica y serotonérgica. Modulación de la plasticidad por diferentes sistemas de neurotransmisión Existen tres receptores principales de glutamato, el neurotransmisor excitador más común en el encéfalo. Éstos son los receptores del ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), kainato y N-metil-D-aspartato (NMDA). Los receptores NMDA se expresan ampliamente en neuronas piramidales y en interneuronas (Alvarez et al, 2007; Collingridge et al, 1983; Nyíri et al, 2003; Oren et al, 2009), y juegan un papel clave en varios eventos de desarrollo del sistema nervioso central, tales como la neurogénesis y migración neuronal (Komuro and Rakic, 1993). Estructuralmente, son heterotetrameros compuestos por dos subunidades GluN1 obligatorias junto con dos subtipos diferentes de las subunidades GluN2 y GluN3. Por lo tanto, la inmunolocalización de la subunidad GluN1 es una herramienta excelente para mostrar la expresión de estos receptores (Moreau and Kullmann, 2013; Paoletti et al, 2013; Sanz-Clemente et al, 2013; VanDongen, 2009). La activación de los receptores NMDA produce varios cambios estructurales en neuronas piramidales, y este efecto se puede conseguir administrando agonistas de estos receptores, siendo uno de los más conocidos la molécula de NMDA. Por una parte, su activación puede producir muerte celular debido a una entrada excesiva de Ca2+ en la célula (Kristensen et al, 2001; Sakaguchi et al, 1997; Shimono et al, 2002). Sin embargo, la administración sub-letal de esta molécula causa alteraciones en la densidad de espinas dendríticas de neuronas piramidales en cultivos primarios del hipocampo (Halpain et al, 1998; Tian et al, 2007). Del mismo modo, los antagonistas de los receptores NMDA también se han utilizado para mejorar nuestra comprensión sobre estos receptores. Uno de los más estudiados es el MK-801, cuya administración afecta a la correcta formación de axones y a la regulación de la sinaptogénesis en neuronas piramidales durante el desarrollo (Butler et al, 1998; Cline and Constantine-Paton, 1990; Shatz, 1990). Por contra, existen muy pocos estudios acerca de la presencia de receptores NMDA en interneuronas (Nyíri et al, 2003) o de cómo estas células inhibidoras alteran su estructura después de su activación o bloqueo. En segundo lugar, como se ha explicado anteriormente, el GABA es el principal neurotransmisor inhibitorio del encéfalo, y es sintetizado y liberado por interneuronas. Existen varios receptores de GABA, que se expresan tanto en neuronas piramidales (Alger and Nicoll, 1982) como en interneuronas (Freund and Buzsáki, 1996). Al igual que ocurría con la manipulación de los receptores NMDA, la activación o inhibición de los receptores de GABA puede alterar la estructura de neuronas piramidales (Curto et al, 2016; Romero et al, 2013; Shimizu et al, 2015). Por último, la serotonina (5-hidroxitriptamina: 5-HT) es una monoamina sintetizada y liberada en el sistema nervioso central por neuronas ubicadas en los núcleos de Raphe, que inervan el neocórtex, el hipocampo y la amígdala (Jacobs and Azmitia, 1992). El papel de la neurotransmisión serotoninérgica está relacionado con comportamientos de bienestar, mientras que su mal funcionamiento está relacionado con varios trastornos psiquiátricos, incluyendo depresión y ansiedad (Andrews et al, 2015). Existen diferentes receptores de 5-HT, autoreceptores y transportadores, estos últimos encargados de la recaptación de 5-HT hacia el elemento presináptico (Fuller and Wong, 1990). Este transportador es especialmente importante por ser una excelente diana farmacológica para los antidepresivos, ya que así se prolonga el tiempo de activación de los receptores de 5-HT (Andrews et al, 2015; Belmaker and Agam, 2008; Fava and Kendler, 2000; Jonnakuty and Gragnoli, 2008; Nestler et al, 2002). Entre este grupo de antidepresivos, la fluoxetina (Prozac, Lilly) es uno de los más utilizados en sociedades occidentales (Byatt et al, 2013; Iñiguez et al, 2014). Además, se piensa que el mecanismo de actuación de este antidepresivo puede estar promoviendo un rejuvenecimiento de la plasticidad neuronal, reabriendo periodos críticos del desarrollo de varias áreas cerebrales (Kobayashi et al, 2010; Vetencourt et al, 2008). Estudios previos de nuestro laboratorio ya han demostrado que el tratamiento crónico con fluoxetina produce un aumento de la densidad de espinas dendríticas de neuronas piramidales de la corteza somatosensorial (Guirado et al, 2009). Sin embargo, todavía no sabemos cómo este antidepresivo afecta la estructura de interneuronas. Modulación de la plasticidad por neurotrofinas Existen muchas neurotrofinas que influyen sobre el desarrollo del sistema nervioso central. Una de las más importantes es el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF por sus siglas en inglés), que ejerce un papel central en el neurodesarrollo y la plasticidad neural (Horch and Katz, 2002; McAllister et al, 1997; Murphy et al, 1998; Tolwani et al, 2002). El BDNF también promueve la potenciación a largo plazo en los circuitos excitadores del neocórtex, hipocampo y amígdala (Escobar et al, 2003; Kang et al, 1997; Meis et al, 2012). En cuanto a la plasticidad estructural, esta neurotrofina provoca un aumento de la densidad de espinas de neuronas piramidales en cultivos organotípicos de hipocampo (Tyler and Pozzo-Miller, 2003), así como un aumento de la complejidad de su árbol dendrítico en la corteza visual en desarrollo (McAllister et al, 1995). Todos estos efectos son desencadenados por la activación del receptor de BDNF, el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB). Este receptor está presente en varias poblaciones neuronales, incluyendo neuronas piramidales (Kokaia et al, 1993; Merlio et al, 1993) e interneuronas (Gorba and Wahle, 1999), y su mal funcionamiento parece jugar un papel clave en la etiología de ciertas enfermedades neuropsiquiátricas como la depresión severa, la esquizofrenia o las enfermedades de Alzheimer y Parkinson (Angelucci et al, 2005; Castrén and Rantamäki, 2010; Pandya et al, 2013; Yoshii and Constantine-Paton, 2010; Zuccato and Cattaneo, 2009). Un fármaco muy interesante para el estudio de la activación de TrkB es la 7,8-dihidroxiflavona (DHF), un compuesto que puede administrarse de forma oral y que cruza fácilmente la barrera hematoencefálica (Du and Hill, 2015). De hecho, su efectividad ha sido recientemente demostrada en varios modelos animales de algunas de estas enfermedades (Castello et al, 2014; Jang et al, 2010; Korkmaz et al, 2014; Zhang et al, 2014, 2015). En algunos casos se ha descrito una mejoría de la sintomatología asociada a alteraciones de la estructura de neuronas piramidales (Castello et al, 2014; Zhang et al, 2015). En modelos animales de envejecimiento, el DHF aumenta la densidad de espinas dendríticas en neuronas piramidales en la amígdala, hipocampo y CPF, consiguiéndose niveles equiparables a los de ratas más jóvenes (Zeng et al, 2012). Sin embargo, todavía no sabemos cómo esta flavona puede alterar las dinámicas estructurales de estas neuronas en animales sanos. Moléculas relacionadas con la plasticidad y plasticidad estructural Existen dos moléculas o compuestos relacionados con la plasticidad de especial interés en esta tesis doctoral: la forma polisializada de la molécula de adhesión celular neural (PSA-NCAM), y las redes perineuronales (PNNs). La primera presenta propiedades antiadhesivas (Rutishauser, 1996), y se expresa ampliamente durante el neurodesarrollo (Doherty et al, 1990; Miller et al, 1994; Rutishauser, 1996; Zhang et al, 1992). En este periodo facilita la migración neuronal, la extensión de neuritas y el remodelado dendrítico y sináptico (Bonfanti 2006; Rutishauser 2008). Su expresión se restringe mucho durante la vida adulta, pero todavía puede encontrarse en diferentes poblaciones de interneuronas del neocórtex adulto (Varea et al, 2005), hipocampo (Gomez-Climent et al, 2011; Nacher et al, 2002a) y amígdala (Nacher et al, 2002b). La depleción de la PSA unida a la NCAM utilizando la enzima endoneuraminidasa-N (EndoN) altera la densidad de espinas dendríticas en neuronas piramidales y en interneuronas que expresan somatostatina (Castillo-Gómez et al, 2016a, 2016b; Guirado et al, 2014). Además, las dinámicas de estas espinas también se alteran tras la administración de EndoN en el hipocampo (Guirado et al, 2014). Por otro lado, las PNNs son estructuras especializadas de la matriz extracelular que rodean a las neuronas y restringen su conectividad y plasticidad (Karetko and Skangiel-Kramska, 2009; De Luca and Papa, 2016; Wang and Fawcett, 2012). Aunque rodean muchos tipos celulares, preferentemente se encuentran alrededor de las interneuronas que expresan parvalbúmina (Nowicka et al, 2009; Ueno et al, 2016). Las PNNs regulan muchas formas de plasticidad (McRae and Porter, 2012); de hecho, se piensa que su aparición, que ocurre bien adentrado el desarrollo neural, es lo que pone fin al periodo crítico de plasticidad aumentada (Hensch and Bilimoria, 2012; Wang and Fawcett, 2012). Es especialmente interesante el descubrimiento de alteraciones en la proporción de neuronas que expresan parvalbúmina y que son rodeadas por PNNs en diferentes paradigmas. Concretamente, estas variaciones se han observado en esquizofrenia (Berretta et al, 2015; Bitanihirwe et al, 2016; Mauney et al, 2013) y tras la administración crónica con fluoxetina (Karpova et al, 2011), pero hipótesis recientes apuntan a que podrían subyacer a otras enfermedades psiquiátricas o trastornos mentales. OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis doctoral es el estudio del impacto de las manipulaciones farmacológicas y ambientales sobre la estructura y dinámica de las neuronas excitadoras e inhibidoras del encéfalo de ratón, en un intento por comprender mejor la plasticidad del sistema nervioso adulto, y las bases neurobiológicas de trastornos psiquiátricos. Para lograr este objetivo principal, derivamos los siguientes objetivos específicos: 1. Estudiar el papel que desempeñan los receptores NMDA en la plasticidad estructural y dinámica de las interneuronas somatostatina del hipocampo. 2. Desarrollar un nuevo modelo de esquizofrenia de ratón, basado en la combinación de estrés por aislamiento social post-destete y del bloqueo perinatal de los receptores NMDA, y reportar sus efectos sobre la corteza prefrontal medial y la amígdala. 3. Analizar si el tratamiento crónico con el antidepresivo fluoxetina afecta la plasticidad del hipocampo y de la corteza prefrontal medial. 4. Estudiar in vivo, utilizando ventanas craneales y microscopía de 2 fotones, los efectos de un tratamiento crónico con el agonista de TrkB 7,8-dihidroxiflavona sobre la dinámica de las neuronas piramidales en la corteza de barriles. METODOLOGÍA Y RESULTADOS Efecto de la modulación de los receptores NMDA sobre la plasticidad estructural de interneuronas que expresan somatostatina Con el fin de entender cómo el bloqueo de los receptores NMDA afecta la densidad de espinas dendríticas y botones axónicos de las interneuronas que expresan somatostatina en el estrato oriens del hipocampo, hemos inyectado MK-801, un antagonista de estos receptores, en ratones transgénicos que expresan EGFP constitutivamente en estas células (ratones GIN, Oliva et al., 2000). Veinticuatro horas tras la inyección, se realizó el test de comportamiento hole-board para obtener una lectura de los comportamientos relacionados con la ansiedad y memoria de trabajo. En la presente tesis muestro que el bloqueo agudo de los receptores NMDA con una inyección de MK-801 no provoca variaciones en la densidad de espinas dendríticas en las interneuronas somatostatina del estrato oriens del hipocampo. Las discrepancias entre nuestros resultados y los obtenidos con neuronas piramidales en otros experimentos pueden deberse a las diferencias estructurales y fisiológicas entre estas células y las interneuronas (Acsády et al, 1998; Freund and Buzsáki, 1996; Gulyás et al, 1992) o, también, a las diferencias en dosis y duración entre tratamientos con MK-801. Sin embargo, los botones axónicos de estas interneuronas sí varían tras la inyección con este antagonista. Estos resultados concuerdan con experimentos realizados por otros laboratorios que muestran sprouting axónico en las colaterales de Schaffer tras un tratamiento de 3 días con MK-801 in vitro (McKinney et al, 1999). Además, hemos encontrado fuertes alteraciones en los comportamientos relacionados con la ansiedad en ratones tratados con MK-801, incluyendo aumentos en la actividad locomotora, los cuales concuerdan con estudios previos utilizando este antagonista (Kalinichev et al, 2008; Zuo et al, 2006). Por el contrario, no hemos encontrado ninguna alteración significativa respecto a la memoria de trabajo en animales tratados, también de acuerdo con resultados previos utilizando el test de hole-board e inyectando MK-801 (Haj-Mirzaian et al, 2015; Hirose et al, 2016). Para poder comprender mejor los resultados obtenidos en espinas dendríticas y botones axónicos, hemos realizado experimentos adicionales con análisis en tiempo real, que permiten el estudio de las dinámicas estructurales de estas células. Para ello hemos preparado y analizado cultivos organotípicos entorrino-hipocampales de la misma cepa de ratones (ratones GIN, Oliva et al., 2000), y a continuación hemos tomado stacks con un microscopio confocal de las mismas dendritas en diferentes tiempos, realizando un estudio en tiempo real de estas estructuras antes y después de la administración del MK-801 y del agonista de los receptores NMDA, la molécula de NMDA. Realizando estos estudios hemos encontrado que 4 horas después de la administración de MK-801, la tasa de aparición de espinas dendríticas disminuye en interneuronas somatostatina del estrato oriens. Estos resultados de disminución del área postsináptica concuerdan con la retracción del árbol dendrítico de interneuronas que se muestra en tiempo real tras la administración de otro antagonista de receptores NMDA, la ketamina (Vutskits et al, 2007). La administración de NMDA no produce ninguna alteración en un período tan corto. Sin embargo, 24 horas tras la administración del MK-801 y el NMDA, los cambios sí son complementarios: MK-801 produce una disminución en la tasa de aparición, mientras que el NMDA provoca un aumento en este parámetro. Además, la administración del NMDA también produce un aumento en la tasa de desaparición y una disminución en la tasa de estabilidad de espinas dendríticas, mientras que MK-801 no causa ningún efecto. Estas alteraciones causadas por la infusión de NMDA pueden deberse a la desestabilización que produce la activación de los receptores NMDA en el citoesqueleto de F-actina (Halpain et al, 1998) o la excitotoxicidad producida por la apertura de receptores de NMDA y la consecuente entrada de calcio en la célula (Kristensen et al, 2001; Mody and MacDonald, 1995; Shimono et al, 2002). Además, también se ha analizado la densidad relativa de espinas dendríticas en ambos experimentos. En el experimento realizado con el antagonista MK-801, se observa una disminución significativa en este parámetro 24 horas después de la infusión del fármaco cuando se comparan con la línea base del grupo, y una tendencia hacia una disminución cuando se compara con el grupo de control. Estos resultados son probablemente consecuencia de las disminuciones en la tasa de aparición que ocurren también en este punto temporal. Sin embargo, cuando los cultivos se tratan con el agonista NMDA, no encontramos ningún cambio en la densidad relativa de espinas dendríticas a lo largo del experimento. Con respecto a las tasas de estabilidad que mostramos en ambos experimentos, existe una discrepancia aparente cuando se comparan los ensayos in vitro e in vivo. De hecho, experimentos de otros laboratorios en tiempo real con ventanas craneales han demostrado que, en condiciones control, las espinas de interneuronas de la corteza visual tienen una estabilidad cercana al 98% (Keck et al, 2011). Sin embargo, la tasa de estabilidad de las interneuronas somatostatina del estrato oriens en ambos ensayos presenta un valor aproximadamente del 70%. Estas discrepancias pueden ser debidas a la diferencia en la estabilidad de diferentes subpoblaciones de interneuronas, a la región y la edad estudiada, o, más probablemente, a una mayor estabilidad in vivo que en nuestros cultivos organotípicos. Estudio de las alteraciones sobre el comportamiento, los circuitos excitadores e inhibidores y la plasticidad molecular, en un modelo de esquizofrenia de doble impacto En la presente tesis, he realizado un estudio multidisciplinar de la esquizofrenia, que combina el análisis conductual, estructural y molecular utilizando un modelo de esta enfermedad en ratones. Éste combina dos modelos simples de la enfermedad, la inyección postnatal de MK-801 y el aislamiento social tras el destete, que juntos conforman un “modelo de doble impacto” con el que además ya hemos obtenido resultados satisfactorios en ratas (Gilabert-Juan et al, 2013a). Con este modelo hemos estudiado la plasticidad estructural de neuronas piramidales (fluorescentes en ratones Thy1-YFP, Feng et al., 2000) y de interneuronas que expresan somatostatina (fluorescentes en ratones GIN, Oliva et al., 2000) en la amígdala y la CPF medial (CPFm). Además, hemos estudiado los comportamientos relacionados con la ansiedad y la memoria de trabajo, y hemos examinado la expresión de moléculas relacionadas con la plasticidad y la neurotransmisión excitadora e inhibidora en estas áreas. En primer lugar, los ratones fueron sometidos al test de hole-board antes de su sacrificio, con el fin de analizar los comportamientos relacionados con la ansiedad, la hiperactividad y las alteraciones de la memoria de trabajo. Los cambios en estos parámetros son bastante comunes en pacientes (Pallanti et al, 2013; Pallanti and Salerno, 2015; Van Snellenberg et al, 2016) y en modelos animales de esta enfermedad (Jones et al, 2011; Lett et al, 2014). En nuestro experimento, los ratones Thy1-YFP del grupo de “doble impacto” y todos los ratones GIN criados en aislamiento (modelo simple de aislamiento y modelo de doble impacto) muestran un aumento en comportamientos relacionados con la ansiedad, tales como el tiempo pasado en la periferia del aparato, la velocidad media o el número movimientos estereotipados que realizaron (rotaciones del cuerpo de 360º). Estos resultados concuerdan con los observados en otros modelos de esquizofrenia basados en la hipofunción de los receptores NMDA (Belforte et al, 2010; Bubeníková-Valešová et al, 2008). Sin embargo, no hemos observado cambios significativos en la memoria de trabajo en ninguno de nuestros modelos. Estos resultados reflejan la controversia que existe hoy en día a cerca de este parámetro en esquizofrenia, en el que algunos estudios sí que han descrito alteraciones en la memoria de trabajo (Andersen and Pouzet, 2004; Nozari et al, 2015), mientras que otros no lo han conseguido (Bubeníková-Valešová et al, 2008; Rompala et al, 2013). En este experimento también se ha estudiado si alguno de los modelos simples de esquizofrenia o el modelo de doble impacto, presentan alteraciones en la expresión de moléculas relacionadas con la plasticidad, y de la neurotransmisión excitadora e inhibidora. Hemos encontrado que tanto los ratones aislados, como los pertenecientes al modelo de doble impacto, presentan una expresión reducida de PSA-NCAM en la amígdala. Este hecho aparentemente contradice informes anteriores que describen aumentos en la expresión de PSA-NCAM en el núcleo basolateral de la amígdala después de experimentar diferentes factores de estrés durante la adolescencia (Tsoory et al, 2008). Nuestros resultados también contrastan con los descritos usando este mismo modelo de aislamiento después del destete en ratas (Gilabert-Juan et al, 2012). Estas diferencias podrían deberse al uso de diferentes especies o al hecho de que el presente estudio ha medido la expresión de estas moléculas en todos los núcleos de la amígdala juntos, y no en sus diferentes subnúcleos. De hecho, disminuciones similares a las que nosotros presentamos se han observado en el núcleo central de la amígdala de ratones y ratas después de un paradigma de estrés crónico (Cordero et al, 2005; Gilabert-Juan et al, 2011). Las alteraciones en PSA-NCAM en la amígdala parecen estar directamente relacionadas con los circuitos inhibidores, ya que esta molécula se expresa en interneuronas en esta región (Nacher et al, 2002b, 2013), hecho que hace que nuestros descubrimientos sean especialmente importantes para entender cómo la esquizofrenia afecta a esta área. Por otra parte, también hemos estudiado si los modelos de esquizofrenia producen algún cambio en la expresión de PNNs que rodean a las interneuronas que expresan parvalbúmina en la amígdala y la CPFm. Hemos encontrado una tendencia hacia la disminución en la región infralímbica de esta última, que está de acuerdo con reducciones similares detectadas en esta área en pacientes esquizofrénicos (Mauney et al, 2013) o en un modelo de ratón de esta enfermedad (Paylor et al, 2016). Del mismo modo, nuestros resultados muestran una disminución en el número de interneuronas que expresan parvalbúmina en la CPF y en la amígdala de nuestro modelo doble, y que también concuerda con las reducciones observadas en pacientes humanos (Enwright et al, 2016), y que coincide con resultados previamente publicados en la CPF en el mismo modelo en ratas (Gilabert-Juan et al, 2013a). También hemos observado un descenso del balance entre excitación e inhibición en la CPFm y en la amígdala de tanto el modelo simple de aislamiento social como el modelo doble. Este equilibrio también puede verse afectado por la expresión de otras moléculas relacionadas con la neurotransmisión excitadora e inhibidora, y que también se han relacionado con modelos animales y pacientes de esta enfermedad. Esto mismo ocurre con la expresión de BDNF, CB1-R, ST8SiaII y St8SiaIV, que se encuentra alterada en seres humanos y otros modelos animales de esquizofrenia, específicamente: un aumento en la expresión de BDNF (Sánchez-Huertas and Rico, 2011) y una disminución en la expresión de ST8SiaIV (Nacher et al, 2010) ambos en la CPF; mientras que en la amígdala aumenta la expresión de CB1-R (den Boon et al, 2014; Volk and Lewis, 2010). Por último, también hemos estudiado si la estructura de neuronas piramidales e interneuronas de amígdala y CPFm varía en los modelos simples de esquizofrenia o en el modelo de doble impacto. En cuanto a las neuronas piramidales, sólo aquellas de la CPFm pudieron ser estudiadas debido a que en la amígdala de ratones Thy1-YFP, la YFP se expresa muy abundantemente, haciendo imposible distinguir neuronas individuales. En la CPF, un estudio anterior utilizando el método de Golgi ha demostrado que las neuronas piramidales reducen su arborización y la densidad de sus espinas dendríticas tras inducir un modelo simple de esquizofrenia (aislamiento tras el destete, Wang et al., 2012). Sin embargo, en nuestro experimento, no encontramos diferencias significativas en la densidad de espinas dendríticas en neuronas piramidales prefrontocorticales, ni en los modelos simples ni en el modelo doble, aunque en este último se observa una tendencia hacia una disminución. Estas discrepancias pueden deberse a diferencias entre especies (rata versus ratones) o a variaciones metodológicas, ya que se utilizaron diferentes técnicas para marcar constitutivamente las neuronas (método de Golgi versus expresión constitutiva de moléculas fluorescentes). Por otro lado, también sería posible que el aumento del número de animales produjera resultados estadísticamente significativos. Por otra parte, la estructura de las interneuronas que expresan somatostatina también se estudió tras la inducción de los modelos simples y el modelo doble de esquizofrenia. Las células Martinotti de la CPFm muestran una mayor densidad de espinas dendríticas en los modelos simples y en el doble. Ya que la mayoría de las sinapsis establecidas en las espinas dendríticas de estas interneuronas son excitadoras (Guirado et al, 2014), este aumento podría representar una ganancia de su superficie sináptica activa. Esto significaría un aumento en la excitación recibida por estas células, lo que finalmente puede conducir a aumentos en la neurotransmisión inhibitoria para compensar la sobreexcitación del sistema. Este resultado concuerda con la elevada neurotransmisión excitadora que se encuentra en esta región en pacientes esquizofrénicos (Starc et al, 2017; Sun et al, 2013) y en modelos animales de este trastorno (Li et al, 2015; Rotaru et al, 2011; Yizhar et al, 2011). Además, también hemos encontrado un aumento en la arborización dendrítica de interneuronas que expresan somatostatina en la amígdala. Estudio de las alteraciones sobre la estructura de interneuronas, la neurotransmisión excitadora e inhibidora, y la plasticidad, tras un tratamiento crónico con fluoxetina En la presente tesis, he tratado de comprender cómo un tratamiento crónico con fluoxetina altera la estructura y conectividad de las interneuronas que expresan somatostatina y la expresión de moléculas relacionadas con la plasticidad, en el hipocampo y en la CPFm. Para ello, hemos inyectado fluoxetina durante 14 días en ratones GIN, en los que una subpoblación de interneuronas que expresan somatostatina expresan constitutivamente la EGFP (Oliva et al, 2000). En el hipocampo, no hemos encontrado cambios en la densidad de espinas dendritas de interneuronas somatostatina, mientras que en la CPFm esta densidad aumenta en interneuronas Martinotti. Debido a que las células que expresan somatostatina reciben principalmente contactos excitadores en sus espinas dendríticas (Guirado et al, 2014), este aumento en la densidad de espinas dendríticas puede producir un aumento de la excitación que reciben estas células, y por lo tanto, un aumento en la inhibición que estas células ejercen sobre las neuronas piramidales. Este incremento en la inhibición coincide con el aumento de la expresión de moléculas relacionadas con la neurotransmisión inhibidora en esta región, que también se ha observado en otros estudios tras un tratamiento crónico con fluoxetina (Guirado et al, 2012; Tiraboschi et al, 2013; Varea et al, 2007a). Por otra parte, la expresión de PSA-NCAM en el hipocampo aumenta en animales tratados crónicamente con fluoxetina. Estos resultados concuerdan con estudios anteriores de nuestro laboratorio en ratas que demostraron aumentos similares en varias regiones cerebrales (Guirado et al, 2012; Varea et al, 2007a, 2007b). Además, en cultivos organotípicos de la CPFm, la depleción de PSA causa alteraciones en la densidad de espinas dendríticas en la misma subpoblación de interneuronas (Castillo-Gómez et al, 2016a), hecho que vincula la expresión de este azúcar con la estructura de estas células. Nuestros resultados también muestran que la proporción de interneuronas que expresan parvalbúmina rodeadas por PNNs está disminuida en el hipocampo y en la CPF de animales tratados con fluoxetina. Estos resultados coinciden con alteraciones similares en otras áreas cerebrales tras tratamientos con este fármaco (Karpova et al, 2011). También hemos analizado cómo un tratamiento crónico con fluoxetina afecta a la densidad de puncta que expresa sinaptofisina, GAD6 (un marcador de sinapsis inhibidoras) y VGlut-1 en el neuropilo de la CPFm y del hipocampo. De esta forma, hemos encontrado un aumento en la expresión de moléculas relacionadas con la neurotransmisión inhibidora (sinaptofisina y GAD6) en el neuropilo del hipocampo, pero no hemos observado ningún efecto en la CPFm. Debido a que no hay cambios en la expresión del marcador sináptico excitador VGlut-1, estos resultados sugieren la formación neta de nuevas sinapsis inhibidoras. En conjunto, estos aumentos están en consonancia con un fuerte incremento de la expresión de PSA-NCAM, ya que en el hipocampo la expresión de esta molécula se asocia principalmente a interneuronas (Guirado et al, 2014; Nacher et al, 2002a). Por último, hemos estudiado cómo el tratamiento crónico con fluoxetina afecta a la densidad del puncta perisomático alrededor de neuronas piramidales. Así, hemos encontrado una tendencia hacia una disminución de la densidad de puncta perisomático que expresa parvalbúmina y sinaptofisina en la CPFm, lo que sugiere una disminución en la densidad de estas sinapsis. Estos resultados concuerdan con estudios previos de nuestro laboratorio en los que la depleción de la PSA causa un aumento en el número de puncta inhibidor alrededor de neuronas piramidales (Castillo-Gómez et al, 2011, 2016a). También hemos analizado la inervación perisomática sobre la misma población de interneuronas en las que se ha estudiado la estructura (interneuronas Martinotti en la CPFm e interneuronas somatostina del estrato oriens en el hipocampo). En estas células, la densidad perisomática de puncta que expresa GAD6 se incrementa después del tratamiento crónico con fluoxetina en el hipocampo, pero no se han encontrado efectos en la CPFm. Estudio en tiempo real de alteraciones sobre las dinámicas estructurales de neuronas piramidales neocorticales durante la activación crónica de TrkB con la 7,8-dihidroxiflavona En la presente tesis describo diferentes alteraciones en las dinámicas estructurales de neuronas piramidales del neocórtex después de un tratamiento crónico de 12 días con el agonista de TrkB, el DHF. Como se ha explicado anteriormente, este tipo de análisis resulta extremadamente importante, ya que se ha sugerido que los cambios en estas dinámicas son la fuerza que promueve la adaptación de los circuitos neuronales a ambientes cambiantes (Bhatt et al, 2009; Caroni et al, 2012; Chen et al, 2012; Holtmaat and Svoboda, 2009; Keck et al, 2011; Knott and Holtmaat, 2008). Para poder realizar este estudio in vivo, he implantado ventanas craneales a ratones Thy1-YFP (Feng et al, 2000; Porrero et al, 2010) y he obtenido imágenes en tiempo real, con un microscopio de 2 fotones, de las mismas dendritas y axones. Además, he realizado un análisis conductual relacionado con el área cerebral neocortical de interés (corteza de barriles), con el fin de correlacionar las alteraciones estructurales y las funcionales. En cuanto a las dinámicas de espinas dendríticas de neuronas piramidales, se observaron diferentes alteraciones: un aumento en la función de ganancia de espinas 4 días después del inicio del tratamiento, y un retorno a los niveles basales al final de éste. Este aumento puede ser debido a la inducción de LTP que causa la activación de TrkB (Minichiello, 2009; Minichiello et al, 2002). Dado que esta forma de plasticidad sináptica produce la aparición de espinas dendríticas (Engert and Bonhoeffer, 1999), el aumento de la función de ganancia no es sorprendente. Por otra parte, la función de estabilidad de espinas dendríticas se reduce gradualmente durante todo el experimento en ambos grupos experimentales, aunque más notablemente en animales control. Esta tendencia parece obedecer a la pérdida de estabilidad natural publicada en la misma cepa de ratones al realizar imágenes en tiempo real (Grutzendler et al, 2002). También he estudiado la dinámica de las espinas dendríticas estables (aquellas presentes al menos durante 4 días), parámetros que son especialmente relevantes porque aseguran la presencia de al menos una sinapsis (Holtmaat et al, 2006; Knott et al, 2006) y , por lo tanto, son los que influyen en la red. Curiosamente, la función de pérdida de espinas estables aumenta significativamente en el grupo control, mientras que el tratamiento de DHF parece que protege contra estos cambios deletéreos. Además, también se observó que las espinas que son estables a lo largo de todo el experimento aumentan su volumen sólo en el grupo de control. Ambos resultados sugieren que el manejo continuo de los animales tiene un efecto deletéreo en la red neural, lo que provoca una pérdida de conexiones estables. Sin embargo, las espinas que se mantienen estables aumentarían su volumen y, en consecuencia, su potenciación, con el fin de mantener sinápticamente el circuito (Matsuzaki et al, 2004). Sugerimos que el DHF, debido a sus propiedades neurotróficas, ejercería un efecto protector rápido contra las repercusiones perjudiciales causadas por la imagen en tiempo real. Este efecto ya se ha demostrado con el DHF, mostrando que protege contra la excitotoxicidad causada por glutamato (Chen et al, 2011a), la hipoxia neonatal y la isquemia (Uluc et al, 2013), o incluso la degeneración de neuronas dopaminérgicas en modelos animales de la enfermedad de Parkinson (Luo et al, 2016) o apoptosis inducida por estaurosporina (Jang et al, 2010). Las dinámicas de los botones de paso axónicos (EPB), varicosidades membranosas que forman los elementos presinápticos localizados en el axón, también fueron estudiadas. Nuestro estudio muestra un incremento en la función de ganancia de EPB 8 días después del inicio del tratamiento y un aumento en la función de ganancia de EPB que se estabilizarán, es decir, aquellos que estarán presentes durante al menos 4 días. También describimos un aumento en la función de pérdida de EPB que fueron estables (EPB que estuvieron presentes durante al menos 4 días y se perdieron después), y una disminución en la función de estabilidad, en animales tratados con DHF. Por otro lado, también hemos tratado de entender si la activación de TrkB con el DHF afectaría el comportamiento dependiente de la corteza barriles. La entrada sensorial de las vibrisas en roedores es recibida por esta región de la corteza somatosensorial. Dado que estos animales utilizan estos bigotes para discriminar diferentes texturas (Arabzadeh et al, 2005; Brecht, 2007; Guić-Robles et al, 1989; von Heimendahl et al, 2007), hemos realizado un test comportamental de reconocimiento de objetos novedosos modificado (Leger et al, 2013), que sirve como correlato para las alteraciones en esta región. Hemos cambiado el protocolo acortando el período entre objetos familiares y nuevos (Burke et al, 2011, 2012), para distinguir adecuadamente entre el comportamiento de reconocimiento de objetos (dependiente de la corteza de barriles, Brecht, 2007; Kleinfeld et al., 2006), y la memoria a largo plazo (dependiente de otras áreas corticales, Simons and Spiers, 2003; Wiltgen et al., 2004). También hemos adaptado los objetos con diferentes texturas para ser detectados principalmente por vibrisas, y hemos usado dos conjuntos de objetos con diferente dificultad para ser reconocidos (fácil y difícil), para así estudiar si el DHF mejora la percepción sensorial depende de la corteza de barriles. Nuestros resultados demuestran que los ratones tratados con DHF presentan una ratio de discriminación de objetos novedosos inferior a la de los ratones tratados con solución salina, lo que significa que son capaces de discriminar mejor los objetos difíciles (emplean menos tiempo en explorarlos) después de ser tratados con DHF. Así, mostramos que esta flavona mejora el comportamiento de reconocimiento de objetos, probablemente alterando la dinámica estructural de las neuronas piramidales de la capa V de la corteza de barriles. Nuestros resultados son una adición necesaria al conocimiento cada vez mayor de cómo la activación de la señalización de TrkB altera la estructura de las neuronas piramidales en el neocórtex.   CONCLUSIONES 1. Las interneuronas que expresan somatostatina del hipocampo expresan receptores NMDA en sus somas y en sus espinas dendríticas. 2. El tratamiento agudo de ratones adultos con el antagonista de receptores NMDA, el MK-801, aumenta la locomoción y los comportamientos relacionados con la ansiedad. 3. El tratamiento agudo de ratones adultos con el MK-801 aumenta la densidad de botones de paso en interneuronas hipocampales que expresan somatostatina, mientras que la densidad de sus espinas dendríticas permanece inalterada. 4. El análisis en tiempo real de las espinas dendríticas de las interneuronas O-LM en cultivos organotípicos del hipocampo revela una disminución rápida en su función de ganancia después de la administración del MK-801. 5. El análisis en tiempo real de las espinas dendríticas de interneuronas O-LM en cultivos organotípicos del hipocampo muestra una disminución en su densidad relativa después de la administración del MK-801. 6. El análisis en tiempo real de las espinas dendríticas de interneuronas O-LM en cultivos organotípicos del hipocampo revela aumentos en sus funciones de ganancia y 24 horas después de la administración del NMDA. 7. El modelo de esquizofrenia de doble impacto en ratón muestra un aumento de la locomoción y los comportamientos relacionados con la ansiedad. 8. Las interneuronas de la amígdala en el modelo de esquizofrenia de doble impacto tienen una mayor arborización dendrítica en comparación con los controles. 9. Los modelos simples de esquizofrenia y el modelo de doble impacto presentan una mayor densidad de espinas dendríticas en interneuronas de la corteza prefontal. 10. La expresión de los marcadores de la neurotransmisión excitadora se incrementa en la amígdala lateral y medial en el modelo de esquizofrenia de doble impacto. 11. La inyección perinatal del MK-801, un modelo simple de esquizofrenia, aumenta la expresión del marcador inhibidor VGAT, y del equilibrio excitación-inhibición, en las regiones infralimbica y prelimbica de la corteza prefrontal. 12. La inyección perinatal de MK-801 aumenta la densidad de interneuronas que expresan parvalbúmina rodeadas por redes perineuronales, en la región infralimbica de la corteza prefrontal. 13. El tratamiento crónico con fluoxetina aumenta la densidad de espinas dendríticas en interneuronas que expresan somatostatina de la corteza prefrontal. 14. El tratamiento crónico con fluoxetina disminuye la densidad de interneuronas que expresan parvalbúmina rodeadas por redes perineuronales, en la corteza prefrontal y en el hipocampo. 15. El tratamiento crónico con fluoxetina aumenta la expresión de PSA-NCAM y sinaptofisina en diferentes regiones del hipocampo. 16. El tratamiento crónico con fluoxetina aumenta la densidad de puncta perisomáticos inhibidores sobre interneuronas pero no en neuronas piramidales de la corteza prefrontal. 17. Las neuronas piramidales de la corteza de barriles expresan TrkB en sus somas, espinas dendríticas y botones axónicos. 18. El tratamiento crónico con 7,8-dihidroxiflavona aumenta la función de ganancia de los botones axónicos y de las espinas dendríticas en las neuronas piramidales del neocortex. 19. La función de pérdida de espinas dendríticas estables, y el volumen de espinas que son estables a lo largo de todo el proceso experimental, permanecen inalterados durante un tratamiento crónico con 7,8-dihidroxiflavona, mientras que se incrementan en animales control. 20. El tratamiento crónico con 7,8-dihidroxiflavona mejora la discriminación de objetos difíciles en el test comportamental de reconocimiento de objetos novedosos. 21. El tiempo de exploración de un objeto nuevo difícil está positivamente correlacionado con la tasa de recambio de espinas dendríticas y botones axónicos en animales tratados con 7,8-dihidroxiflavona, pero no en controles.