Parásitos aporocotílidos (platyhelminthestrematoda) de peces perciformes del mediterráneo occidental. Interés en acuicultura

Resumen

Introducción general Una de las consecuencias del aumento de la población humana es el incremento en la demanda de proteína animal. Para satisfacer esa gran demanda se han sobrexplotado la mayoría de caladeros pesqueros del mundo y, como consecuencia, ha incrementado exponencialmente la producción de peces en acuicultura. De hecho, en el año 2014 la producción acuícola supero a la pesca extractiva por primera vez en la historia. España se encuentra entre los 25 mayores productores de pescado de cultivo del mundo, con la dorada, Sparus aurata L., y la lubina, Dicentrarchus labrax (L.), como principales especies producidas, con un incremento cercano al 4% anual en el pasado lustro. Sin embargo, los precios en el mercado de estas especies están cerca del precio de coste, con lo que se hace cada vez más necesario la diversificación de especies para la estabilización del mercado. Existen varias especies con cualidades organolépticas y requerimientos de cultivo similares a los de la dorada y, por ello, con potencial para ser criadas en acuicultura; entre ellas varias especies de la familia Sparidae, como sargos (Diplodus spp.), la mojarra (Pagellus erythrinus (L.)) o el besugo (Pagellus bogaraveo (Brünnich)). Otro de los grandes protagonistas del sector acuícola por su elevado precio en el mercado es el atún rojo del Atlántico (Thunnus thynnus (L.)). En esta especie, aunque el volumen de producción sea muy inferior al de otras especies, tiene un valor de mercado que supone el 10% del total mundial (FAO, 2016; APROMAR, 2017). La producción de todas estas especies no está exenta de retos, desde la domesticación de las especies, la producción de alimento óptimo, hasta el control de las condiciones sanitarias de los animales. La producción intensiva en elevadas densidades de peces aumenta las posibilidades de aparición de enfermedades, su frecuencia e intensidad (Woo et al., 1995; Fioravanti et al., 2006; Nowak, 2007). El conocimiento de la diversidad de patógenos que puede afectar a una especie de pez es esencial para la gestión y control de enfermedades. Aunque los problemas patológicos más habituales en acuicultura están ligados a virus, bacterias y protistas, los parásitos metazoos están también involucrados en enfermedades muy perjudiciales (p. ej. los calígidos y girodactílidos en los salmones); dentro de estos parásitos metazoos, se encuentran los trematodos digeneos, siendo los aporocotílidos uno de los que más riesgos conllevan para la producción de peces (Ogawa, 2015). En esta tesis se incluyen cinco trabajos sobre aporocotílidos en diferentes especies de peces con interés para la acuicultura: P. erythrinus, P. bogaraveo, S. aurata y T. thynnus. Los aporocotílidos se caracterizan por vivir en el sistema circulatorio de peces, por la ausencia de ventosa ventral (típica de digeneos) y por la presencia de espinas en los laterales del cuerpo. El ciclo vital de estos parásitos es heteroxeno, con el adulto viviendo habitualmente en corazón y branquias, donde libera huevos que quedarán atrapados en los capilares más finos de las branquias de los peces. Cuando los huevos maduran, los miracidios eclosionan y salen al exterior a través del tejido del pez, en busca del hospedador intermediario (poliquetos o caracoles). Dentro del hos­pedador intermediario la larva se reproduce asexualmente dando lugar a esporocistos y cercarias. Cuando la cercaria emerge, nada activamente hasta el hospedador definitivo penetrando a través de la piel, branquias, ojos o aparato digestivo. Finalmente el juvenil de aporocotílido migra hasta su michohábitat definitivo y cierra el ciclo (Smith, 1972; 1997; Bullard y Overstreet, 2002). El proceso infectivo lleva consigo una serie de efectos patológicos para los peces infectados. Los huevos acumulados en las branquias y la eclosión de los mismos ocasionan obstrucción de la circulación y reducen la superficie respiratoria pudiendo ocasionar la muerte del pez (Bullard y Overstreet, 2002; Paperna y Dziwoski, 2006; Cribb et al., 2011; Ogawa, 2015). Esta tesis tiene el propósito de aportar nueva información sobre la diversidad y los problemas que ocasionan los aporocotílidos presentes en varias especies de peces con interés para la acuicultura abordando las siguientes cuestiones: (i) ¿Es común la presencia de aporocotílidos en peces espáridos? De ser así, ¿pueden afectar a nuevos cultivos o a los ya establecidos? (ii) ¿Están subestimados los aporocotílidos en el atún rojo del Atlántico? Si están presentes, ¿pueden afectar a los cultivos de atún? (iii) ¿Cómo se distribuyen los aporocotílidos dentro del sistema circulatorio de los diferentes hospedadores? ¿Puede el microhábitat de los adultos o los huevos estar relacionado con los daños del parásito? (iv) ¿Cómo utilizar la información obtenida para la gestión en acuicultura? A continuación se resumen los estudios realizados en los diferentes capítulos de la tesis, que tratan de dar respuesta a los objetivos citados. Skoulekia erythrini n. sp. (Digenea: Aporocotylidae): un parásito de Pagellus erythrinus (L.) (Perciformes: Sparidae) del Mediterráneo occidental y corrección de la diagnosis del género. Introducción Los aporocotílidos adultos suelen vivir en el corazón o las branquias de sus hospedadores, aunque también se han citado en otras localizaciones como vasos mesentéricos, riñón, hígado, cinturas pectorales o vasos meníngeos (Smith, 2002; Paperna y Dzikowski, 2006; Montero et al., 2009; Alama-Bermejo et al., 2011). Los aporocotílidos adultos suelen ser difíciles de encontrar y se detectan más fácilmente por la presencia de huevos atrapados en la branquia. Hasta la fecha de publicación de este trabajo se habían citado cuatro especies de aporocotílidos en peces espáridos, de los cuales solo dos en el Mediterráneo. En este estudio parasitológico se encontraron trematodos sanguíneos en Pagellus erythrinus, Diplodus vulgaris (Geoffroy Saint-Hilaire) y D. puntazzo (Walbaum), pertenecientes a dos especies de Skoulekia Alama-Bermejo, Montero, Raga y Holzer, 2011: S. meningialis Alama-Bermejo, Montero, Raga y Holzer, 2011 y una nueva especie de este género. Se aporta la descripción de ambas especies, diagnosis corregida del género Skoulekia y datos sobre histopatología branquial. Material y métodos Se analizaron 166 ejemplares de P. erythrinus de cuatro localidades de la costa mediterránea española: 63 ejemplares de D. puntazzo y 8 de ­. Se examinaron en solución salina bajo la lupa binocular el corazón, seno venoso, conductos de Cuvier, bulbo arterial, aorta dorsal, venas cardinales, riñón y cerebro. Las arterias branquiales se examinaron meticulosamente. Posteriormente los filamentos branquiales se fijaron en formalina al 4% para histología.Los aporocotílidos se fijaron en etanol 70% para microscopía, en formalina 4% para microscopía electrónica de barrido y cortes semifinos y en etanol absoluto para análisis molecular. Los ejemplares fijados en etanol 70% se tiñeron en acetocarmín férrico y se montaron en bálsamo de Canadá. Los dibujos se realizaron con un miscrocopio Nikon Optiphot-2 con tubo de dibujo asociado, se digitalizaron y se tomaron las medidas mediante el programa ImageTool 3.0. Los ejemplares tipo se depositaron en el Museo de Historia Natural de Londres y en la colección de la Unidad de Zoología Marina de la Universitat de València. Se hicieron extracciones de ADN de los ejemplares en etanol absoluto y se amplificaron y secuenciaron los genes ribosómicos ITS2, 18S y 28S. Se hicieron dos alineamientos de secuencias para ITS2 y 28S y se analizaron mediante inferencia Bayesiana (IB) y por máxima verosimilitud (MV). Resultados Los aporocotílidos hallados en D. vulgaris y D. puntazzo se encontraron en el encéfalo de los peces y se identificaron como Skoulekia meningialis. Los ejemplares obtenidos de P. erythrinus se encontraron en el riñón cefálico (n=7), corazón (n= 4), branquias (n=3) y filtrado sanguíneo general (n= 30). La mayoría de ejemplares eran grávidos, pero se encontraron dos inmaduros. La prevalencia media (P%) fue del 13,9% y la intensidad media (IM) de 1,9 gusanos por pez infectado. Los caracteres morfológicos y moleculares indican que se trata de una nueva especie dentro del género Skoulekia, S. erythrini n. sp. Existe una amplia variación morfológica en los ejemplares grávidos dependiendo del grado de desarrollo somático, incrementándose principalmente en anchura tanto el cuerpo, como el testículo y el ovario. La histología de las branquias del pez reveló una mayor prevalencia del parásito y mostró que los huevos de S. erythrini se acumulaban en las lamillas secundarias con un tamaño y forma similar al de los huevos intrauterinos. Morfológicamente la nueva especie encaja en general bien en la diagnosis del género Skoulekia, lo que queda claramente apoyado por los estudios moleculares. Algunos caracteres difieren de la diagnosis del género: cuerpo prácticamente simétrico (vs. curvado lateralmente), conducto vitelino ventral al ovario (vs. dorsal) y la extensión del útero es anterior al ovario (vs. posterior al ovario). También presenta caracteres diferentes respecto a la especie tipo, S. meningialis, como espinas más cortas con extremo romo, glándulas esofágicas difusas, esófago relativamente más largo, ciego anterior izquierdo generalmente más largo que el derecho y un testículo más corto respecto al cuerpo. Otros caracteres difieren en su media, tanto respecto a la descripción original como respecto a los nuevos ejemplares encontrados. La reexaminación de ejemplares tipo de S. meningialis mostró algunos caracteres no descritos o que diferían de la descripción original. Las medidas de los nuevos ejemplares muestran que la variabilidad morfológica de S. meningialis es mayor a lo descrito hasta el momento. Los resultados del estudio filogenético muestran a S. erythrini junto S. meningialis en un clado con fuerte soporte tanto para 28S, con una divergencia del 1,9% (28 nt.), como en ITS2, 1,8% (10 nt.) entre ambas especies. Los géneros más próximos a Skoulekia, que forman un clado con origen monofilético junto él, son Psettarium Goto y Ozaki, 1930 y Pearsonellum Overstreet y Køie, 1989. Discusión Skoulekia erythrini es la segunda especie de su género, la tercera especie de aporocotílido descrita en el Mediterráneo y la quinta en peces espáridos. La descripción de la nueva especie y la cita de S. meningialis en un nuevo hospedador, D. puntazzo, afianzan la idea de que los espáridos son hospedadores habituales de aporocotílidos (Alama-Bermejo et al., 2011). Los datos morfológicos aportados por los nuevos ejemplares, los paratipos reexaminados y las observaciones en la nueva especie permiten una diagnosis del género más detallada y corregida. Los caracteres diagnósticos que permitirán diferenciar al género Skoulekia del más parecido morfológicamente, Psettarium (cuya descripción fue modificada recientemente por Yong et al. (2016)) son: cuerpo no cóncavo ventralmente, ciegos posteriores llegando a solapar con el ovario y útero lateral al ovario pudiendo extenderse anteriormente a este. Los datos moleculares confirmaron la identidad de S. meningialis en D. puntazzo y la proximidad entre las especies de Skoulekia. El análisis de ITS2 sigue siendo insuficiente para esclarecer de manera firme la relación entre los géneros Skoulekia, Psettarium y Pearsonellum. Serían necesarias más secuencias de especies de estos géneros. Acorde con datos pasados y del presente estudio, se hace evidente que la detección de aporocotílidos es mejor mediante el análisis de branquias que evidencien presencia de huevos (Palacios-Abella et al., 2015). Trematodos sanguíneos en Pagellus spp. (Sparidae) patología y descripción de una nueva especie de Skoulekia en el besugo, P. bogaraveo (Brünnich). Introducción El besugo, Pagellus bogaraveo, es una de las especies más apreciadas en el área mediterránea, con un precio elevado que suele elevarse notablemente en ciertas épocas del año como la Navidad. El cultivo de esta especie se lleva a cabo desde los 90 en la costa atlántica de la Península Ibérica, y se está intentando introducir en otros países del Mediterráneo (Peleteiro et al., 2000; Mladineo, 2005; Parisi et al., 2014; Iaconisi et al., 2017). Otra especie de Pagellus Valenciennes con potencial interés para su cultivo es la mojarra, P. erythrinus (Basurco et al., 2011). Para poder implementar nuevos cultivos es necesario estudiar los potenciales patógenos que puedan comprometer su correcto desarrollo. Los aporocotílidos son un grupo de parásitos que ya se ha detectado en cultivos de otro espárido bien conocido, como es la dorada, en donde se vio su relación con mortalidades puntuales (Padrós et al. 2001). Estos parásitos pueden ser muy virulentos y causar mortandades masivas, en parte debido a su inusual ciclo de vida entre los trematodos, con un único hospedador intermediario que puede reinfectar desde las estructuras de la propia granja (Bullard and Overstreet, 2002; Ogawa, 2015). Además su transmisión no es por vía trófica, sino por penetración activa de la cercaria al pez (Køie, 1982). En este estudio se ha llevado a cabo un análisis parasitológico e histológico para describir a parásitos aporocotílidos y las patologías que pueden causar a en peces del género Pagellus. En análisis recientes de ejemplares salvajes de P. erythrinus y P. bogaraveo se han detectado aporocotílidos de la especie Skoulekia erythrini en las branquias de la mojarra y una nueva especie de Skoulekia en el cerebro del besugo. Se han descrito los microhábitats de los huevos y los adultos dentro del hospedador. El objetivo final es evaluar el potencial patogénico en estos valiosos cultivos. Material y métodos Se han analizado en fresco 20 ejemplares de besugo y 30 de mojarra procedentes de Santa Pola, España. Se examinaron bajo la lupa binocular el corazón, seno venoso, conductos de Cuvier, bulbo arterial, aorta dorsal, venas cardinales, riñón y cerebro. Los filamentos branquiales se separaron del arco y se fijaron de inmediato en formalina 4% para histología, revisando previamente las arterias branquiales en busca de aporocotílidos adultos. Los ejemplares obtenidos se fijaron en etanol absoluto, al 70% y formalina 4% para su posterior análisis molecular y morfológico (incluyendo microscopia electrónica de barrido). Los cortes histológicos obtenidos de branquias se tiñeron en hematoxilina y eosina. Se registró la posición de cada huevo detectado en los cortes, se tomaron fotografías y se midió el tamaño de los huevos y el calibre de los vasos sanguíneos de la branquia. Se realizaron dibujos a partir de ejemplares teñidos con acetocarmín férrico y montados en bálsamo de Canadá, mediante un miscrocopio Nikon Optiphot-2 con un tubo de dibujo asociado. Las medidas se tomaron a partir de las imágenes digitalizadas con el programa ImageJ 1.48v. Los ejemplares tipo se depositaron en el Museo de Historia Natural de Londres. Se llevó a cabo un análisis filogenético para la nueva especie por IB y MV, usando los marcadores ITS2 y 28S. Resultados En el análisis de los cerebros de P. bogaraveo se encontraron adultos de Skoulekia sp. en el 45% de los peces, con 1,9 parásitos por pez infectado. Aunque no se observaron coágulos o alteraciones significativas, los vasos meníngeos de los peces infectados estaban claramente congestionados y expandidos en el lugar donde se encontraba el parásito adulto. No se encontraron aporocotílidos en cerebros de mojarra. Los caracteres morfológicos observados y los datos moleculares del aporocotílido encontrado en P. bogaraveo dieron lugar a la descripción de una nueva especie: Skoulekia bogaraveo n. sp. La nueva especie aparece agrupada en un clado con buen soporte junto a las otras dos especies de Skoulekia, S. meningialis y S. erythrini, tanto por IB como MV en los análisis de ITS2 y 28S. Las distancias genéticas respecto a las otras dos especies son muy homogénea: 1–1,1% para 28S y entre 1,7–2,4% para ITS2. En los cortes histológicos de P. bogaraveo aparecieron frecuentemente huevos de Skoulekia bogaraveo n. sp. El 70% de los peces tenía al menos un arco branquial con huevos. Los 156 huevos hallados se encontraban acumulados en la parte basal del filamento, bajo el septum; el 77% se encontraba en la arteria aferente del filamento (AFA) y el 23% en las arteriolas aferentes de las laminillas (ALA); sin presencia en las lamillas secundarias. Los vasos donde se hallaban los huevos estaban claramente dilatados. En el 47% de los casos el huevo se hallaba encapsulado en la parte basal de la AFA o en ALA basales. Estos huevos encapsulados podían duplicar el tamaño de un huevo normal y provocaban una desorganización del tejido circundante. El 53% de los huevos no estaba encapsulado siendo elipsoidales y alargados, con lo que parecían proyecciones polares de la cáscara, en algunos casos; el tamaño de los huevos es de 33–62 × 15–28 (media 44 × 22) µm (n= 30) y podían llegar hasta la zona media del filamento. No se han encontrado adultos en cortes de branquia. En cortes de P. erythrinus aparecieron huevos de Skoulekia erythrini. Un 60% de los peces tenía al menos un arco branquial infectado. Se vio una diferencia muy marcada en cuanto a la distribución de los huevos de las dos especies de Skoulekia dentro de la branquia de sus respectivos hospedadores. Los 621 huevos detectados se concentraban en la parte media y distal del filamento. El 54% se encontró en las laminillas secundarias, el 29% en las ALA y el restante 17% en la AFA. Únicamente se apreciaba una ligera dilatación en los capilares de las lamillas por la presencia de los huevos. Solamente el 4% de los huevos estaba encapsulado y al inicio de la AFA. Los huevos no encapsulados eran también elipsoidales y alargados, midiendo 26–38 × 13–17 (30 × 15) µm (n= 40). No se han encontrado adultos en cortes de branquia, pero sí, en fresco, en branquias, corazón y riñón. Discusión En este estudio se describe una nueva especie de aporocotílido en el besugo y la distribución y patologías asociadas a la presencia de huevos de aporocotílido del género Skoulekia en las branquias de sus respetivos hospedadores. Skoulekia bogaraveo n. sp. es la tercera especie de su género y su hallazgo refuerza la idea de que los espáridos son hospedadores habituales para los aporocotílidos, así como que los vasos sanguíneos del cerebro deben ser un microhábitat habitual para las especies del género Skoulekia. En lo que concierne a la inclusión de la nueva especie dentro del género Skoulekia, los caracteres morfológicos encajan perfectamente con la diagnosis del género y esto se corrobora con los datos genéticos (Alama-Bermejo et al., 2011; Palacios-Abella et al., 2017). Las tres especies del género son muy parecidas entre sí, pero podemos diferenciar a S. bogaraveo n. sp. respecto de S. erythrini principalmente por la forma y apariencia del testículo, más alargado y definido, pero también por una menor extensión del ciego posterior derecho respecto al ovario. Por otro lado, podemos diferenciarla de S. meningialis por tener espinas más cortas y en menor número por fila. Otros caracteres que diferencian a S. bogaraveo n. sp. de las otras dos especies se basan en valores medios: cuerpo ligeramente más alargado, anillo nervioso más estrecho, ovario ligeramente más alargado, viteloducto más ancho y ootipo elipsoidal en lugar de esférico. A pesar de que los hospedadores y los parásitos de este estudio son congenéricos la distribución de los huevos y de los adultos es diferente en ambas especies de Pagellus. La distribución diferencial se puede atribuir al mayor tamaño de los huevos de S. bogaraveo n. sp. respecto a los de S. erythrini; ya que el calibre de los vasos sanguíneos de ambos peces era prácticamente el mismo. Los huevos de S. erythrini, más pequeños, alcanzan los capilares de la laminilla sin aparente daño al tejido, mientras que los de S. bogaraveo, de mayor tamaño, quedan encapsulados en la base de la AFA, con importantes efectos en los tejidos circundantes. Aparentemente, el bloqueo circulatorio y la reacción asociada a los huevos de S. bogaraveo n. sp. parecen ser más dañinos que los efectos asociados a la mayor dispersión de los huevos de S. erythrini. Sin embargo, el daño más habitual causado por aporocotílidos es la alteración y pérdida de epitelio branquial (Paperna and Dzikowski, 2006); teniendo en cuenta esto, S. erythrini tendría mayor capacidad para dispersarse a zonas más vulnerables de la branquia. La capacidad de dispersión y el potencial patogénico han sido citados anteriormente en el caso de especies de Paradeontacylix McIntosh, 1934 en el pez limón, siendo más dañinas las especies con mayor dispersión (Repullés-Albelda et al., 2008). La presencia de aporocotílidos adultos también puede ocasionar problemas como trombosis o necrosis en diferentes órganos de sus hospedadores, como meningitis crónica en aporocotílidos cerebrales. Todos estos efectos pueden verse incrementados si la carga parasitaria aumenta significativamente, como se ha visto que sucede en condiciones de cultivo. Por lo tanto debe considerarse a S. bogaraveo n. sp. como una amenaza potencial para futuros cultivos de besugo. Este estudio confirma que existen multitud de especies de aporocotílidos en espáridos, por lo que conviene continuar los estudios de estos parásitos en nuevos cultivos, sabiendo que pueden provocar grandes pérdidas. Una vez descritos, es necesario un seguimiento continuado de los peces y medidas de profilaxis para evitar episodios graves de aporocotilidosis. Nueva especie de Cardicola (Trematoda, Aporocotylidae) en la dorada Sparus aurata L. del Mediterráneo Occidental. Introducción De los géneros que forman la familia Aporocotylidae (Trematoda: Digenea), el género Cardicola Short, 1953 tiene el mayor número de especies. Hasta la fecha, se han citado cinco especies de Cardicola en el Mediterráneo, una de ellas en la dorada Sparus aurata L. Durante diferentes análisis parasitológicos de S. aurata, se recolectaron dos especies de aporocotílidos en Italia (en peces de cultivo) y en España (en peces salvajes y de cultivo): C. aurata Holzer, Montero, Repullés, Nolan, Sitjà-Bobadilla, Álvarez-Pellitero, Zarza y Raga, 2008 y una nueva especie de Cardicola. El objetivo de este estudio es aportar una caracterización morfológica y molecular de los aporocotílidos encontrados, así como esclarecer sus relaciones filogenéticas. Material y métodos Se muestrearon 155 doradas durante la primavera de 2017: 115 procedentes de cultivo en Cerdeña (Italia), 20 de granjas de del Mediterráneo español y 20 salvajes de Cullera (España). Los peces se examinaron en fresco, analizando corazón, seno venoso, conductos de Cuvier, bulbo arterial, vasos branquiales, aorta dorsal, venas cardinales, riñón y cerebro, bajo una lupa binocular. Los aporocotílidos recolectados fueron fijados en etanol 70% para análisis morfológico y etanol absoluto para análisis molecular. Los parámetros de infección (P% y IM) se calcularon según Bush et al. (1997). Se obtuvieron secuencias de ITS2 y 28S, y se realizó un análisis filogenético por IB y MV, para ambos marcadores. Resultados Se encontraron un total de 39 aporocotílidos adultos. En Cerdeña 25 ejemplares se identificaron como Cardicola aurata (P% 18,3; MI: 1,2) y 8 como Cardicola n. sp. (P%: 7; MI: 1). En las doradas de granjas españolas se detectó un adulto de Cardicola n. sp. (P% 5; MI: 1) y 5 Cardicola n. sp. en doradas salvajes (P% 25; MI: 1,2). Los especímenes de Cardicola n. sp. se encontraron en el corazón (n = 3) y vasos branquiales (n = 2); los ejemplares de C. aurata se detectaron únicamente en los vasos branquiales (n = 4). Sin embargo, la mayor parte de aporocotílidos se encontró en el filtrado general de la sangre (n =30). Los nuevos ejemplares de C. aurata encajaban bien con los caracteres diagnósticos de la descripción original, sin embargo había algunas diferencias, como una menor longitud de la vesícula seminal, la forma del receptáculo seminal oviducal y la mayor longitud del metratermo y el consiguiente desplazamiento del poro genital femenino. Cardicola n. sp. se diferencia fácilmente del resto de especies por tener unos ciegos posteriores notablemente diferentes en longitud (el derecho mucho más largo que el izquierdo) y por tener la parte anterior del testículo hendida medialmente. Cardicola n. sp. comparte con C. aurata, C. palmeri Bullard y Overstreet, 2004; C. opisthorchis Ogawa, Ishimaru, Shirakashi, Takami y Grabner, 2011, C. bullardi Nolan, Miller, Cutmore, Cantacessi y Cribb, 2014 y C. cardiocolus (Manter, 1947) Short, 1953 que todas ellas presentan los dos poros genitales posteriores al ootipo, un conducto ovovitelino lateral o posterior al ootipo y el útero completamente dirigido hacia la parte anterior desde el ootipo. Los dos últimos rasgos también se observan en C. whitteni Manter, 1954, C. forsteri Cribb, Daintith y Munday, 2000 y C. langeli Bullard, 2013; esta última especie también posee el ciego posterior derecho más largo que el izquierdo (aunque no tan desigual como en Cardicola n. sp.). Además, Cardicola n. sp. comparte con la especie tipo C. cardiocolus, C. aurata y C. langeli (las tres especies de Cardicola que infectan a los espáridos) y C. bullardi la presencia de un ventosa oral provista de filas concéntricas de espinas diminutas. El análisis filogenético del 28S tiene buen soporte en los nodos principales tanto para IB como ML. Las dos especies obtenidas de dorada aparecen juntas, basales al resto de especies de Cardicola y cerca de las de Paradeontacylix. Sin embargo, el árbol obtenido de ITS2 no tiene buen soporte y la topología difiere de la del 28S. En este último árbol Cardicola n. sp. aparece basal al resto de taxones, los cuales producen una politomía de siete ramas. Paradeontacylix y Braya Nolan y Cribb, 2006 aparecen como clados monofiléticos entre varias especies de Cardicola. Las distancias intragenéricas observadas en Cardicola son similares a las distancias intergenéricas respeto a otros géneros de aporocotílidos. Discusión Habitualmente los aporocotílidos infectan a un solo hospedador, pero un mismo pez puede ser infectado por más de una especie (Palacios-Abella et al., 2015; Yong et al., 2016), sin embargo, ésta es la primera vez que se cita para espáridos. El género Cardicola tiene una taxonomía particularmente compleja; se describen nuevas especies continuamente, corrigiendo y expandiendo la diagnosis de este género (Smith, 2002; Nolan and Cribb, 2006; Holzer et al., 2008; Ogawa et al., 2011). Además existe una gran variabilidad genética que sugiere que, cuando se dispongan de más secuencias, este género puede ser dividido en varios. A pesar de las diferencias entre el 28S y el ITS2, Cardicola n. sp. parece tener una clara posición basal al resto de especies del género. Los rasgos morfológicos arriba citados, que asemejan a Cardicola n. sp. con las especies que infectan a espáridos, incluyendo la especie tipo, hacen factible que esta esta nueva especia pueda seguir siendo Cardicola después de una futura reevaluación del género. Sin embargo, la posición filogenética respecto a las especies en espáridos y, sobre todo, con respecto a la especie tipo no se podrá resolver hasta que no haya nuevas secuencias, ya que actualmente solo existen secuencias para C. aurata. A pesar de la gran producción de dorada no ha habido nuevas citas de aporocotilidosis en este pez desde Holzer et al. (2008), ni en granjas ni en peces salvajes. Los aporocotílidos pueden pasar desapercibidos o ser ignorados en análisis rutinarios, y a menudo solo cuando se producen mortandades o pérdidas de producción se buscan aporocotílidos específicamente. Después de este estudio al menos dos especies pueden afectar al cultivo de dorada. Existen diversas citas de mortandades masivas en cultivos afectados por más de una especie (Ogawa y Egusa, 1986; Repullés-Albelda et al., 2008; Sughigara et al., 2014). Afortunadamente, las especies que infectan la dorada son fácilmente distinguibles morfológicamente y esto facilita su identificación. Caracterización morfológica e identificación de cuatro especies de Cardicola Short, 1953 (Trematoda: Aporcocotylidae) infectando al atún rojo del Atlántico Thunnus thynnus (L.) en el mar Mediterráneo. Introducción La familia Aporocotylidae está compuesta por 37 géneros, hasta la fecha de publicación de este trabajo, que infectan el sistema circulatorio de peces condríctios y osteíctios. Suelen pasar desapercibidos y se detectan habitualmente por la presencia de huevos en las branquias del hospedador. El género Cardicola es muy amplio con más de 30 especies y con gran impacto en acuicultura (Holzer et al., 2008), con cinco especies infectando atunes (escómbridos). Se les considera el grupo de patógenos potencialmente más dañino para granjas de atún en Japón y Australia (Shirakashi et al., 2012). En el Mediterráneo, la actividad de cría del atún rojo se centra en el engorde de esta especie y no ha experimentado grandes daños por aporocotílidos. En este estudio se han analizado muestras de atunes salvajes y de granja, detectando varias especies de Cardicola. El objetivo del trabajo ha sido identificar los aporocotílidos presentes en atunes del Mediterráneo. Material y métodos Se han examinado un total de 274 atunes salvajes de cuatro zonas del Mediterráneo occidental y 147 ejemplares de una granja de engorde. Una vez llegaban a puerto, las branquias y corazón se congelaban en bolsas individuales a -20º C. Las branquias se diseccionaban, anotando la localización de los huevos según Culurgioni et al. (2014). Para detectar los huevos se extraía una pareja de filamentos, de cinco zonas de cada arco branquial. Los filamentos se sumergían en glicerol y se observaban bajo la lupa y el microscopio. Los corazones se diseccionaban en rodajas y se agitaban en solución salina para que los parásitos adultos se soltaran. Los parásitos obtenidos se fijaban en etanol 70% y se teñían en carmín férrico para su estudio morfológico; previamente, se cortaba un fragmento de algunos ejemplares y se fijaba en etanol absoluto para posterior identificación molecular; igualmente con algunas muestras de huevos homogéneas morfológicamente. Los parámetros de infección (P% y MI) se calcularon según Bush et al. (1997) y los intervalos de confianza (IC) se obtuvieron con el programa Quantitative Parasitology 3.0. (QP3). Se evaluaron las posibles diferencias en el tamaño de los atunes con el test de la t de Student, las posibles correlaciones entre tamaño del atún y la abundancia de parásitos con el coeficiente de correlación de Spearman y las diferencias de prevalencia e intensidad entre las poblaciones de parásitos con el test de Fisher y Welsh respectivamente. Se extrajo ADN de ejemplares adultos y de muestras entre 50–100 huevos, y se amplificaron el gen ribosómico ITS2 y un fragmento del gen mitocondrial de la citocromo c oxidasa I (cox1). Las secuencias de ITS2 se alinearon con otras de Cardicola spp. disponibles en GenBank, y se obtuvieron arboles filogenéticos por inferencia IB y MV. Resultados Cardicola forsteri ya había sido descrito en Thunnus maccoyii (Castelnau) de Australia y citado en T. thynnus del Atlántico norte y Mediterráneo, pero no había ejemplares descritos en el Mediterráneo anteriormente (Aiken et al., 2007). Los especímenes de este estudio, comparados con la descripción original, eran más grandes y con la vesícula seminal más larga. Cardicola opisthorchis se describió en T. orientalis (Temminck y Schlegel) de Japón, y se había citado una secuencia genética similar en T. thynnus del Mediterráneo, pero sin descripción del ejemplar (Aiken et al., 2007; Ogawa et al., 2011). Los especímenes descritos en este estudio tenían el cuerpo, testículo y ovario más estrecho y el receptáculo seminal oviducal más corto. Cardicola orientalis Ogawa, Tanaka, Sugihara y Takami, 2010 se describió en T. orientalis en Japón y ha sido citado también en T. maccoyii en Australia (Shirakashi et al., 2013). Ésta es la primera cita de esta especie en T. thynnus y en la cuenca atlántica. Los ejemplares descritos tenían el esófago, los ciegos anteriores y la vesícula seminal más largos que los descritos en las otras especies de atún. Las secuencias obtenidas a partir de huevos indican que no pertenecen a ninguna de las especies de Cardicola descritas hasta la fecha, y probablemente pertenezcan a una nueva especie. La morfología de los huevos de Cardicola sp. es indistinguible de los huevos de C. orientalis. Durante el estudio se detectaron adultos de Cardicola spp. en el 37% de los peces examinados. C. opisthorchis tuvo la mayor prevalencia y abundancia tanto en atunes de granja (P = 23%, IM = 2,7) como salvajes (P = 6%, MI = 4,5). Cardicola forsteri y C. orientalis mostraron una prevalencia e intensidad media similares tanto en granja (P = 4%, IM = 1,0 y P = 5%, IM = 1,0 respectivamente), como en atunes salvajes (P = 2%, IM = 1,0 y P = 3%, IM = 1,5 respectivamente). A pesar de las diferencias de tamaño del pez entre localidades, no hubo relación entre tamaño y prevalencia y abundancia de aporocotílidos. Únicamente C. forsteri se encontró tanto en branquias como en corazón. Cardicola opisthorchis solo en corazón y C. orientalis solo en branquias. Aparecieron casos de coinfección por C. forsteri y C. opisthorchis en corazón de atunes de granja y salvajes. La prevalencia de aporocotílidos basada en presencia de huevos fue significativamente mayor en granja que en medio salvaje (67% vs. 2%) Las secuencias de ITS2 obtenidas para las tres especies de Cardicola fueron idénticas a las ya presentes en GenBank. En el árbol obtenido por ambos métodos IB y MP, C. aurata aparece basal al resto de especies, dentro de las cuales C. forsteri y C. opisthorchis son linajes hermanos formando un mismo clado, al igual que C. orientalis y Cardicola sp. Discusión Ésta es la primera vez que se citan cuatro especies de Cardicola en una misma especie de pez hospedador. También se cita por primera vez a C. orientalis en T. thynnus, y se aportan descripciones tanto de adultos como de los huevos de varias de las especies. Es necesario encontrar al adulto de Cardicola sp. para dar una descripción formal de la especie. Las observaciones de este estudio muestras que todas las especies de Cardicola que infectan a los otros atunes rojos del Pacífico están en el Mediterráneo. Este hecho se podría explicar por diferentes hipótesis: i) el ancestro de los actuales atunes rojos ya estaba infectado por todas las especies de Cardicola, ii) las tres especies de aporocotílidos se han transmitido entre atunes en zonas donde solapen sus distribuciones, o iii) las fases larvarias se han dispersado dentro los hospedadores intermediarios del ciclo como fauna incrustante en los cascos de los barcos. La mayor prevalencia de Cardicola spp. en granjas hace suponer que en ellas se den unas condiciones más favorables para la infección. Las pequeñas diferencias entre los ejemplares descritos en este estudio y los de anteriores trabajos podrían ser atribuibles a la adaptación a un hospedador diferente, al tamaño del pez, al grado de maduración del parásito o incluso al método de recolección, fijado y preservación. La detección de huevos de aporocotílidos en branquias es el mejor método para diagnosticar infecciones de Cardicola, pero la coinfección dificulta su identificación a nivel específico. Son necesarios más datos sobre la morfología de huevos en branquias, ya que los huevos intrauterinos pueden variar su morfología una vez liberados. Cada especie de Cardicola parece tener diferente grado de patogenicidad, virulencia, y resistencia a antihelmínticos por lo que se hace necesario la identificación a nivel específico con el final de desarrollar e implementar medidas y tratamientos específicos para combatirlas. Efectividad de diagnóstico para un nuevo método de microscopía óptica para la detección de huevos de Cardicola spp. en filamentos de atún rojo. Introducción Los trematodos aporocotílidos del género Cardicola son una seria amenaza para los cultivos de atunes (Nowak, 2004). Los huevos liberados en el torrente sanguíneo quedan atrapados, principalmente, en corazón y branquias, lo que compromete la salud del pez, reduciendo la producción en granjas, e incluso provocando mortandades masivas principalmente en peces juveniles (Dennis et al., 2011). Hasta el momento se han detectado cuatro especies de Cardicola en atunes de todo el mundo, estando las cuatro presentes en el Mediterráneo (Palacios-Abella et al., 2015). La detección de huevos en filamentos branquiales es la manera habitual de diagnosticar aporocotilidosis; ya sea por histología o por análisis en fresco bajo la lupa o digestión del tejido. El problema reside en el gran tamaño de las branquias de un atún adulto con miles de filamentos y en el tiempo necesario para su análisis, por eso, conocer cómo se distribuyen los huevos de Cardicola spp. dentro de las branquias ayudaría a elaborar un método de diagnóstico de rápido y de fácil aplicación. El objetivo de este trabajo es comparar la sensibilidad de diferentes técnicas para la detección de huevos teniendo en cuenta el coste y el tiempo, y estudiar la distribución de los huevos para finalmente diseñar un método más preciso y rápido de diagnóstico. Material y métodos Entre 2011 y 2013 se recogieron 100 branquias de atún rojo del Atlántico proce­den­tes de granja de engorde. Los atunes medían entre 127–254 cm de longitud. Las branquias se congelaron a -20 ºC y se transportaron al Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología Evolutiva donde fueron analizados. Para las pruebas preliminares se recogieron algunas muestras adicionales. Para estudiar la distribución de los huevos de Cardicola spp. en branquias, se extrajeron una pareja de filamentos de cada una de las cinco áreas transversales en las que se dividió cada uno de las ocho holobranquias: 1 hipobranquial, 2 y 3 ceratobranquial, 4 unión epi-ceratobranquial, y 5 epibranquial (40 áreas en total). Los filamentos se examinaron por ambas caras (α y β) con la lupa binocular entre 20-40×. El método óptimo de observación se determinó después de diferentes pruebas. Adicionalmente se realizó un estudio a menor escala espacial de distribución de huevos por hemibranquia, área longitudinal del arco (basal, central, distal) y lado del filamento (α y β). Para el análisis estadístico se creó una matriz de datos con los datos de presencia/ausencia de huevos por áreas transversales con los 100 atunes. Se exploró la distribución de acuerdo a i) la holobranquia, ii) todo el conjunto de áreas transversales y iii) por áreas transversales de cada holobranquia. La prevalencia de huevos se calculó según Bush et al. (1997) y el IC 95% con el método de Sterne en el programa QP3. La intensidad media se calculó según el número de áreas infectadas por pez (1 a 40), y el CI se calculó con el paquete BootEs de R. Las diferencias en las prevalencias e intensidades se calcularon con el test de Fisher y test de remuestreo de Welsh respectivamente. La zona 1 de los arcos 1 y 2 no se incluyó en el análisis estadístico porque solía faltar o estar incompleta debido al protocolo de extracción de la granja. Se probaron diferentes métodos de diagnóstico abreviados (IM), basados en combinaciones de diferentes zonas infectadas de las branquias. El examen de todas las áreas transversales se consideró el método estándar de referencia (RSM) con el que se compararon. El estadístico Kappa de Cohen se usó para valorar la fuerza de los porcentajes de concordancia de los IM frente al RSM. Resultados El mejor procedimiento para observar los huevos dentro de los filamentos fue con una lupa con campo claro oblicuo a 40×, con filamentos descongelados y sumergidos en glicerol. Se detectaron huevos en el 92% de los atunes. No hubo diferencias en prevalencia o intensidad entre las branquias del lado derecho e izquierdo. Tampoco se vieron diferencias en prevalencia e intensidad entro las diferentes holobranquias. Sí existieron diferencias entre las áreas transversales de las holobranquias para prevalencia e intensidad, siendo el área 5 la que presentaba mayor presencia de huevos, y las zonas 3 y 4 las que menos. La prevalencia de la submuestra (n = 30) elegida para el estudio de distribución no fue diferente a la del total. No se hallaron diferencias entre las hemibranquias o entre los lados α y β, pero sí se vio que la zona basal y central estaban más infectadas que la distal. Basados en combinaciones de diferentes holobranquias y áreas transversales, se seleccionaron tres métodos abreviados: i) analizar las áreas transversales 2 y 5 de todas las holobranquias (“A2+A5”), analizar las cinco áreas de las holobranquias 2 y 4 de ambos lados (“H2+H4”) y analizar las áreas 2 y 5 de los tres arcos más externos y las cinco áreas de las holobranquias 4 (test T-Two). La sensibilidad de los tres métodos respecto al RSM fue de más del 90%, siendo el “test T-Two” el más sensible (97%) con un Kappa de 0,826. No hay diferencias significativas entre las prevalencias obtenidas tras analizar los atunes con el RSM y el “test T-Two”. Discusión La prevalencia de infección por Cardicola spp. en los atunes utilizados en este trabajo, del Mediterráneo norte español, (P% = 92%) es notablemente mayor a la de granjas situadas más al sur (P% = 30–43%) o a granjas del Adriático (P% = 63%) (Ruiz de Ybañez et al., 2011; Mladineo and Tudor, 2004). Las diferencias en la incidencia de Cardicola spp. podrían explicarse por factores abióticos como temperatura o salinidad: sin embargo en este caso las diferencias entre localidades podrían deberse a la mayor exhaustividad de este estudio junto con una metodología más sensible a la hora de detectar huevos de aporocotílido. Recomendamos congelar la muestra, ya que el proceso facilita el secado del mucus y la aglutinación del suero sanguíneo, mejorando la visión de los huevos. La inmersión en glicerol elimina más agua del tejido y lo transparenta mejorando el paso de la luz. No se recomienda fijar previamente en etanol o formalina ya que esto aumenta la opacidad del tejido. Este es el primer estudio de distribución de huevos de Cardicola spp. en T. thynnus. A diferencia de lo citado en T. maccoyii, donde se observó que la segunda holobranquias estaba más infectada que la cuarta (Norte dos Santos et al., 2012), en este estudio no se observa diferencias significativas entre las diferentes holobranquias, a pesar de tener algo más de infección en el cuarto arco. En T. orientalis se cita que la cuarta holobranquias es aparentemente la menos infectada, pero hay que ser cauto a la hora de comparar los resultados ya que los atunes de aquel estudio eran pequeños juveniles y los de este trabajo eran adultos de gran tamaño. Respecto a las diferencias encontradas en la distribución por áreas transversales y longitudinales, éstas podrían explicarse por la anatomía del sistema circulatorio de la branquia. Los huevos se acumulaban en los extremos del arco, zona 1, 2 y 5, donde acaban las ramas de la arteria branquial aferente, debido a una menor velocidad de flujo por el incremento de la resistencia vascular. Esta resistencia vascular se debe a un estrechamiento en los extremos de la arteria y a un menor diámetro basal de las arterias aferentes, asociado a filamentos más cortos en los extremos de las holobranquias. El hecho de que la zona 5 sea la que presenta una mayor infección se puede deber a una menor longitud media de los filamentos y su mayor resistencia vascular, que empuja a los huevos a distribuirse entre más filamentos, sumado a la menor longitud de la rama posterior de la arteria branquial, lo que aumentaría la concentración de filamentos infectados respecto a la parte anterior del arco. Es interesante el hecho de que en T. orientalis de pequeño tamaño se observe la zona 3-4 como la más infectada por huevos de C. orientalis (Shirakashi et al., 2012); los autores lo atribuyeron a que el parásito adulto vive en los vasos, por lo que atunes más grandes, como en nuestro caso, pueden avanzar hacia los extremos de la arteria. En T. maccoyii no se encuentraron diferencias entre áreas transversales, pero hay que decir que solo distinguieron 3 áreas que son combinación de áreas poco y muy infectadas en equivalencia con nuestro estudio. Las diferencias en la distribución de huevos entre la zona basal y medial, respecto a la distal del filamento pueden explicarse por unas arteriolas aferentes de mayor calibre y más ramificadas en la zona basal del filamento. El desarrollo de técnicas de detección de huevos de aporocotílidos es esencial para el control de aporocotilidosis, sobre todo en peces de gran tamaño como el atún. La histología o la digestión no tienen capacidad para analizar una parte representativa de muestras tan grandes de manera eficiente. Los medios moleculares son muy sensibles pero requieren equipos caros y especializados así como investigadores cualificados. Aquí proponemos al “test T-Two” como un método sencillo, rápido, económico y eficiente, que puede usarse en granjas e investigación. El número de branquias necesarias para detectar un cierto patógeno dependerá de los parámetros de infección. Asumiendo la sensibilidad del 96,8% del “test T-Two” y diferentes niveles hipotéticos de infección, 10%, 40% y 90%, sería necesario analizar 43, 10, o 3 branquias, respectivamente, para tener un nivel de confianza del 99% en la detección del parasito. Por todas las ventajas del “Test T-Two” se propone como método estándar para análisis rutinarios de las granjas de atún rojo del Atlántico, pudiendo ser adoptada para otras especies de Thunnini, después de hacer estudios específicos para probar su validez. Conclusiones 1. La nueva especie Skoulekia erythrini Palacios-Abella, Georgieva, Mele, Raga, Isbert, Kostadinova y Montero, 2017 es el primer aporocotílido descrito en Pagellus erythrinus. A diferencia de la especie tipo, que vive en cerebro, S. erythrini ha sido encontrada en vasos sanguíneos del riñón, corazón y branquias. 2. El hallazgo de Skoulekia meningialis Alama-Bermejo, Montero, Raga y Holzer, 2011 en un nuevo hospedador, Diplodus puntazzo, implica que este parásito no es especifico de especie. 3. La diagnosis del género Skoulekia ha sido corregida en base a los caracteres de la nueva especie, S. erythrini, y la nuevo estudio de ejemplares de S. meningialis. La nueva descripción incluye mayor variabilidad en la forma del cuerpo, extensión del testículo y disposición del útero. 4. Una segunda especie de aporocotílido, Skoulekia bogaraveo Palacios-Abella, Raga, Mele y Montero 2018, ha sido descrita en Pagellus bogaraveo. El género Skoulekia está compuesto actualmente por tres especies que parasitan espáridos, muy similares entre ellas y con gran variabilidad morfológica intraespecífica. Los datos moleculares del ADNr 28S y ITS2 corroboran la validez del género Skoulekia y dan soporte a la fuerte relación filogenética entre los géneros Skoulekia, Psettarium y Pearsonellum. 5. El análisis histológico de branquias de Pagellus erythrinus y P. bogaraveo mostró dife­rencias en la distribución de los huevos en los vasos sanguíneos de las branquias relacionadas con el tamaño relativo de los huevos de Skoulekia erythrini y S. bogaraveo y al calibre de los vasos de sus respectivos hospedadores. Los diferentes efectos patológicos observados en ambos hospedadores parecen estar relacionados con la capacidad de dispersión de los huevos de aporocotílido. 6. El potencial efecto patológico descrito para aporocotílidos y las frecuentes altas cargas parasitarias descritas para estos parásitos en acuicultura sugiere que las patologías descritas en especies de Pagellus de medio salvaje pueden dificultar el cultivo de estas apreciadas especies. Estos parásitos deben tenerse en cuenta en las inspecciones rutinarias de peces de cultivo. 7. Una nueva especie de Cardicola (Aporocotylidae) se ha descrito en Sparus aurata de medio salvaje y en cultivo. La nueva especie de Cardicola fue detectada en España y Cerdeña (Italia). Éste es el segundo aporocotílido que infecta a S. aurata, junto con C. aurata; ambas especies puede que fuesen confundidas en diagnósticos patológicos rutinarios previos basados en la detección de huevos en branquias. 8. Después del análisis de nuevos ejemplares de Cardicola aurata, se revisaron algunos caracteres morfológicos específicos. Los caracteres corregidos más significativos fueron la extensión del metratermo y la posición del poro genital femenino, lo que es relevante para la taxonomía de los aporocotílidos. 9. La gran variabilidad morfológica del género Cardicola, la amplia variabilidad intraespecífica para los marcadores 28S e ITS2 y los análisis filogenéticos resultantes (incongruentes parcialmente entre ellos) sugieren una futura reevaluación del género Cardicola. 10. La descripción de tres nuevas especies de aporocotílidos en hospedadores de la familia Sparidae, junto con la descripción previa y el hallazgo de un nuevo hospedador para Skoulekia meningialis, refuerza la idea de que los espáridos del Mediterráneo son hospedadores habituales de aporocotílidos. 11. El atún rojo del Atlántico Thunnus thynnus está infectado por Cardicola forsteri, C. opisthorchis, y C. orientalis en el Mar Mediterráneo. Además, está presente una cuarta especie de Cardicola, identificada por análisis molecular de huevos en branquias. C. forsteri y C. orientalis son circunglobales, parasitando a las tres especies de atún rojo (T. maccoyii, T. orientalis y T. thynnus). 12. El número de adultos de Cardicola spp. Encontrados, tanto atunes de granja como en atunes salvajes, fue bajo, probablemente debido a la dificultad de encontrar aporocotílidos. C. opisthorchis fue significativamente más frecuente en granja que en medio salvaje. 13. La prevalencia de huevos de Cardicola spp. en Thunnus thynnus procedentes de granja de engorde fue mucho mayor que la de atunes salvajes de diferentes localidades del Mediterráneo occidental, indicando que las condiciones de cultivo favorecen el ciclo de vida de los aporocotílidos. 14. El estudio de la distribución de los huevos de Cardicola spp. en branquias de Thunnus thynnus no mostró diferencias significativas entre holobranquias. Sin embargo se observaron diferencias dentro de cada holobranquia: se detectó mayor infección en los filamentos de los extremos anterior y posterior de cada holobranquia y en la parte basal y central de cada filamento. Las diferencias en la distribución de los huevos se han relacionado con el flujo sanguíneo, la distribución del sistema circulatorio y la resistencia vascular. 15. Se ha propuesto un nuevo método para la detección de huevos de aporocotílidos llamado “test T-Two”, para optimizar y estandarizar la diagnosis de aporocotilidosis en atún rojo. El método consiste en analizar filamentos de las áreas 2 y 5, de las holobranquias I a III y de todas las áreas de las holobranquias IV. Los filamentos se analizan después de descongelar y transparentar en glicerol. El “test T-Two” es sencillo, económico y rápido respecto a los métodos actuales de diagnóstico. 16. Son recomendables análisis rutinarios específicos junto con medidas profilácticas para prevenir episodios graves de aporocotilidosis. La detección de huevos en branquias es la mejor manera de diagnosticar la presencia de aporocotílidos por la dificultad de encontrar parásitos adultos. Encontrar el hospedador intermediario viviendo cerca de cultivos o en las propias jaulas es necesario para desarrollar procedimientos de limpieza preventivos para detener el ciclo el vital de los parásitos.