Optimización de las técnicas de criopreservación del tejido adiposo

Resumen

Objetivos Uno de los progresos más notables en cirugía plástica en los últimos años ha sido la utilización y perfeccionamiento de las técnicas para el manejo del tejido adiposo (TA). Uno de los principales problemas de los injertos de TA es la tasa de reabsorción, que implica procedimientos repetidos de lipoaspiración y lipoinyección, aumentando los costes y complicaciones quirúrgicas, así como el dolor y disconfort para el paciente. Esta es la razón por la que la criopreservación de TA sería extremadamente útil. El objetivo de este estudio es desarrollar un protocolo de criopreservación de TA que simplifique de manera significativa los protocolos desarrollados hasta el momento, sin disminuir la funcionalidad y la viabilidad del TA después de la descongelación y el trasplante. Material y Métodos Se compararon dos temperaturas (Tª) de congelación (-20º y -80º) y dos agentes crioprotectores (ACPs): trehalosa e hidroxietilstrach (HES), mediante un protocolo de congelación lenta. Para ello, el TA de 4 pacientes fue extraído y procesado mediante la técnica de Coleman. A continuación el TA fue dividido en 5 grupos experimentales y procesado de la siguiente forma: • Grupo Control: TA fresco. • Grupo 1: Tª -20ºC (medio Dulbecco’s Modified Eagel Medium (DMEM)/F2, 10%HES). • Grupo 2: Tª -80ºC (medio DMEM/F2, 10%HES). • Grupo 3: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 0.35M trehalosa). • Grupo 4: Tª -80ºC (medio DMEM/F2, 0.35M trehalosa). Tras 1 semana las muestras fueron descongeladas mediante inmersión en baño a 40ºC y procesadas para evaluar la morfología (estudios histológicos) y viabilidad tisular (estudios moleculares: la expresión génica de Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)). A partir de los resultados obtenidos se procedió a la realización del estudio “in vivo” eligiendo como Tª de criopreservación -20ºC. Injertos de TA procedente de 6 pacientes y extraídos siguiendo el mismo procedimiento que en el estudio previo fueron trasplantados en ratones inmunodeficientes (n=15). Las muestras de cada paciente fueron divididas en 5 grupos experimentales y a continuación pesadas y procesadas de la siguiente forma: • Grupo Control: TA fresco. • Grupo A: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 10% de HES), TA criopreservado 1 mes. • Grupo B: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 10% de HES), TA criopreservado 2 meses. • Grupo C: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 0.35 trehalosa), TA criopreservado 1 mes. • Grupo D: Tª -20ºC (medio DMEM/F2, 0.35 trehalosa), TA criopreservado 2 meses. Tras 1 mes post-inoculación los animales fueron sacrificados procediéndose a la recuperación de las muestras las cuales fueron pesadas y procesadas para su estudio histológico, estudio de viabilidad (expresión de GAPDH) y estudio de vascularización (expresión génica de Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular o VEGF). Resultados El estudio histológico inicial, demostró que las muestras de TA de los grupos criopreservados (Grupos 1-4) mostraban unas características histológicas normales y similares a las del grupo control (fresco). Se observó expresión de GAPDH en todos los grupos experimentales (Control: 4,72±0,13; Grupo1: 7,02±2,33; Grupo 2: 9,02±2,70; Grupo 3: 4,64±0,91; Grupo 4:6,31±-0,65). No se observaron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) cuando se compararon los grupos criopreservados entre ellos o con el grupo control. En cuanto a los estudios “in vivo”, los grupos criopreservados (A-D) presentaron un buen prendimiento y conservación de la arquitectura típica del TA en comparación con el grupo control (fresco), así como una evidente red vascular indicativa de un proceso de neovascularización. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) en cuanto a la tasa de prendimiento (%) (Grupo Control 33,77±9,63; A: 18,88±5,41; B: 32,17±14,19; C: 22,10±9,83; D: 26,09±15,40) expresión génica de GAPDH (Grupo Control: 6,81±0,63; A: 6,74±0,43; B:6,54±0,84; C:6,17±0,17; D:7,26±0,62) o expresión génica de VEGF (Grupo Control: 16,17±1,72; A: 14,93±1,94; B: 14,27±2,52; C: 15,49±1,61; D: 16,61±1,63) cuando se compararon los grupos criopreservados entre ellos o con el grupo control. Conclusiones La congelación lenta de TA a -20ºC con trehalosa o con HES supone un procedimiento de criopreservación de TA sencillo y simple con resultados similares al TA fresco en términos de viabilidad tisular y características morfo-histológicas. La utilización de estos dos ACPs de baja toxicidad constituyen un protocolo sencillo aplicable a la práctica clínica habitual. El tiempo de criopreservación de las muestras no influye en la adecuada conservación del TA.