Biogénesis y plegamiento de proteínas de membrana

Resumen

I. Introducción. En las células eucariotas las proteínas de membrana son sintetizadas por ribosomas que están anclados a la membrana del retículo endoplásmico para permitir su plegamiento e inserción en la bicapa lipídica de forma cotraduccional. La maquinaria celular que permite tanto la translocación al retículo endoplásmico de las proteínas de secreción como el paso e inserción al entorno lipídico en el caso de los fragmentos transmembrana es un complejo de proteínas denominado translocón (Song, W. et al., 2000). El translocón está compuesto por un heterotrímero de las subunidades Sec61¿, ß y ¿, dónde Sec61¿ formaría las paredes del canal. Este poro acuoso está alineado con el túnel de salida del ribosoma (Beckman, R. et al., 1997), de manera que a medida que las cadenas nacientes emergen del ribosoma se introducen en el canal del translocón donde serán translocadas ó integradas en la bicapa lipídica cotraduccionalmente. El mecanismo de integración de los diferentes fragmentos transmembrana de una proteína es un proceso complicado, ya que requiere la correcta orientación de los TMs por parte del ribosoma y el translocón para poder coordinar la correcta liberación y adquisición de la topología adecuada (hacia el citoplasma o hacia el lumen) de los segmentos consecutivos de la cadena naciente que van siendo traducidos. La coordinación entre ribosoma y translocón debe ser precisa para impedir la permeabilidad a iones que produciría desajustes metabólicos en la célula; es por esto por lo que se piensa que deben existir interacciones entre componentes del ribosoma, de la membrana, lumenales y citosólicos que permitan una fina regulación del proceso. Por la cara citosólica, el poro permanece cerrado por la unión del ribosoma al translocón (Crowley et al., 1993) y en la cara luminal por la chaperona BiP (Hamman, B.D., et al., 1998) que además de favorecer el plegamiento de la cadena naciente translocada, proporciona direccionalidad al proceso. Esta comunicación entre ribosoma y translocón induce a pensar en una potencial discriminación por parte del ribosoma de la naturaleza de las secuencias aminoacídicas que están siendo traducidas (Liao et al., 1997; Woolhead et al., 2004; Woolhead et al., 2006) para que tenga lugar su correcto plegamiento y direccionamiento a su destino. Asociadas a los componentes que forman el núcleo central del translocón, el complejo Sec61, existen otras proteínas implicadas en los procesos de translocación, inserción y modificación posttraduccional. Una de éstas proteínas es la denominada TRAM (translocating chain-associating membrane protein) (Gorlich, D., et al., 1992). En nuestro laboratorio se describió la interacción de la proteína p9 del virus del moteado del clavel con Sec61¿ y con TRAM durante el proceso de integración de la proteína vírica en la membrana del RE (Sauri et al., 2005). En diferentes laboratorios, la proteína TRAM ha sido detectada en experimentos de entrecruzamiento interaccionando con secuencias señal de proteínas de secreción y con fragmentos TM que presentan algún residuo cargado (Meacock et al., 2002), además, se requiere para la translocación de proteínas de secreción con secuencias señal poco hidrofóbicas (Do et al., 1996; Görlich et al., 1992; Meacock et al., 2002; Voigt et al., 1996). Por todo ello, se ha propuesto que puede desempeñar su función en las proximidades del traslocón como una 'chaperona de membrana', estabilizando los fragmentos TM con residuos hidrofílicos y facilitando la asociación de estos fragmentos hasta que son liberados, una vez ensamblados, al medio hidrofóbico de los lípidos. En el caso de las células procarióticas la proteína YidC, que presenta una topología similar a TRAM, es necesaria para la integración y el plegamiento de algunas proteínas de membrana, por lo que podría tener una función análoga (Dalbey and Kuhn, 2004). Curiosamente, YidC interacciona en experimentos de entrecruzamiento con cadenas nacientes de proteínas de bacteriofagos como M13 y Pf3 (de Gier and Luirink, 2003), por lo que la interacción observada en nuestro laboratorio entre nuestra proteína modelo y TRAM podría ser una reminiscencia de este tipo de interacciones en células eucariotas, en las que para la integración de las proteínas de membrana virales se requeriría la participación de la chaperona de membrana TRAM. II. Objetivos. II.1 Plegamiento en el interior del ribosoma - Estudio comparativo del plegamiento de diferentes secuencias transmembranales y no transmembranales en estadios tempranos de su biogénesis, cuando todavía se encuentran en el interior del túnel ribosomal. En este capítulo se abordará cuáles son los determinantes que gobiernan el plegamiento en el interior del túnel. II.2 Caracterización de la proteína TRAM. Implicación en los procesos de inserción de proteínas en la membrana del RE. II.2.1 Caracterización de la proteína. - Biogénesis. - Topología. - Ambiente proteico que rodea a TRAM. II.2.2 Estudios funcionales: Papel en la integración de regiones TM de distinta naturaleza. Se pretende estudiar si la ausencia de TRAM afecta a la inserción en la membrana del retículo endoplásmico de la proteína p9 del virus del moteado del clavel, así como de diversos segmentos TM: de origen viral (el de la proteína gp41 del VIH-1) y no viral. Además nos proponemos la identificación de los determinantes de secuencia responsables de estas interacciones. II.3 Oligomerización en la bicapa lipídica de fragmentos TM de proteínas de fusión víricas. Una vez estudiada la adquisición de estructura secundaria dentro del túnel ribosomal del TM de la proteína gp41 del VIH-1, su integración en la membrana y la posible dependencia de TRAM para la correcta inserción en la bicapa, nos propusimos determinar si este TM es capaz de oligomerizar por sí mismo y, si es así, identificar qué residuos son los que juegan un papel determinante en este proceso. El análisis de las secuencias de los fragmentos TM de estas glicoproteínas de virus animales pone de manifiesto la existencia prácticamente en todas ellas de un motivo GXXXG (G, glicina; X, cualquier otro aminoácido. Este motivo se ha observado frecuentemente en hélices TM (Russ and Engelman, 2000) y se le ha atribuido una importancia capital en la estabilización de interacciones entre fragmentos TM, a cuya identificación ha contribuido de forma significativa la investigación realizada en nuestro laboratorio (Orzaez et al., 2005; Orzaez et al., 2000; Orzáez et al., 2004). III. Metodología. -Para el estudio de la adquisición de estructura secundaria dentro del túnel ribosomal se utilizó una aplicación de la técnica conocida como 'mapeo por glicosilación' (Whitley, P. et al, 1996; Mingarro, I. et al, 2000). Cadenas nacientes ancladas al ribosoma que reproducen intermediarios del proceso de traducción/inserción se generan a partir de RNAs mensajeros que carecen de codones de parada. De esta manera se consigue que la secuencia objeto de estudio quede secuestrada en el interior del túnel ribosomal, permitiendo el estudio de esa zona en concreto. -Para caracterizar la proteína TRAM se utilizaron diversas técnicas. 1) La estrategia seguida para determinar la biogénesis y mecanismo de inserción de TRAM se denomina fotoentrecruzamiento y ha sido ampliamente utilizada para el estudio de las interacciones entre los polipéptidos nacientes y los componentes del translocón del retículo endoplásmico (RE) (Johnson and van Waes, 1999). 2) La topología de la proteína TRAM ha sido descrita utilizando una aproximación basada en el mapeo por glicosilación y adaptada a la determinación de topología de proteínas de membrana politópicas. En una primera fase, la becaria que presenta este informe diseñó el método y lo validó como nueva técnica para la determinación de proteínas de membrana politópicas. Una vez validado se describió la topología de TRAM y ésta se confirmó mediante transfección y sobrexpresión en células humanas en cultivo (HeLa). 3) En la determinación del ambiente proteico que rodea a TRAM se combina la sobreexpresión de la proteína en células en cultivo con entrecruzamiento químico. Se sobreexpresa la proteína y 24h después las células son tratadas con diversos agentes químicos que entrecruzan residuos de la proteína objeto de estudio con residuos aminoacídicos de compañeros que se encuentren próximos a ella, y por tanto, nos den indicios de dónde está localizada. Tras el entrecruzamiento las células se lisan y se realiza un western anti-TRAM para comprobar si se han generado aductos de mayor masa molecular. Los aductos deben ser analizados por inmunoprecipitación o espectroscopía de masas para identificar con qué otro componente está interaccionando TRAM. -Para estudiar el papel que juega la proteína TRAM en la inserción en la membrana del RE de diversas proteínas de membrana se eligió una técnica basada en la inhibición de la expresión de TRAM mediante el uso de RNAs de interferencia (silenciamiento de RNA) en células humanas en cultivo .