Evaluación del riesgo de la presencia de micotoxinas en piensos comercializados en españa mediante métodos cromatográficos multidetección y alta resolución optimizados

Resum

Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por determinados hongos, y son contaminantes frecuentes de alimentos y piensos. Producen enfermedades, denominadas micotoxicosis, que pueden ser tanto agudas como crónicas en personas y animales. A nivel de salud humana afectan fundamentalmente al hígado, los riñones y el sistema inmune, mientras que sus efectos en salud animal son más variados, dependiendo de otros factores como la especie, la edad, etc. La Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (“International Agency for Research on Cancer”, IARC) ha clasificado las aflatoxinas como uno de los compuestos naturales con mayor potencial cancerígeno y teratógeno que existen en la naturaleza, incluyéndolas dentro del grupo I de su clasificación, mientras que ha clasificado a otras micotoxinas, como la ocratoxina A, el deoxinivalenol y las fumonisinas dentro del grupo de posibles cancerígenos (grupo 2). Debido a su importancia en salud pública, se han establecido límites legales en los niveles de concentración de micotoxinas en alimentos y piensos comercializados dentro de la Unión Europea y se han establecido además requisitos tanto en la toma de muestras como en los métodos de análisis aplicados al control de micotoxinas. Además, y debido, por una parte, a la extraordinaria variedad química y posibles efectos toxicológicos que pueden tener las micotoxinas, y por otra, a factores externos como el cambio climático, las instituciones sanitarias mantienen, como una de sus principales líneas de trabajo relacionada con el control de contaminantes ambientales, la constante monitorización y estudio toxicológico de micotoxinas, para determinar sus posibles efectos en la salud humana o animal. Por ello, la legislación alimentaria europea relacionada con micotoxinas se encuentra en constante evolución, incluyendo nuevos productos alimenticios, nuevos niveles de concentración para las micotoxinas ya legisladas, o realizando nuevas incorporaciones como ha ocurrido recientemente con la citrinina o los tricotecenos. La producción ganadera ocupa un lugar muy importante en la cadena alimentaria. La presencia de la micotoxina aflatoxina M en la leche animal, producto de la metabolización en el hígado animal de la aflatoxina B1, o la presencia de ocratoxina A en huevos y carne de cerdo o aves, son ejemplos de la importancia del control, dentro de la seguridad alimentaria, de los niveles de concentración de micotoxinas presentes en los piensos que ingieren los animales. Dado el gran número de micotoxinas existentes, y la falta de datos relativos a su toxicidad y efectos en la salud humana y animal para la gran mayoría de ellas, puede presuponerse como factible la aparición de otras micotoxinas en productos de origen animal en el futuro. Por ello, la tendencia presente y futura es el aumento del control de la presencia de micotoxinas en piensos, estableciendo niveles de concentración más restrictivos en las ya conocidas y la inclusión de otras nuevas, así como la generalización de los criterios en los planes de muestreo y análisis establecidos en alimentos para micotoxinas. Los piensos destinados a alimentación animal constituyen matrices complejas desde un punto de vista analítico, debido, por una parte, a la gran variedad de posibles ingredientes que pueden formar parte de su composición y por otra, al estado de conservación en el que se pueden encontrar. Por ello, mientras que, para otras matrices como la de los cereales, la metodología analítica ha tenido un gran desarrollado en la literatura, los piensos no han tenido el mismo interés. Por ello, los datos relativos a la incidencia de la contaminación de piensos por micotoxinas son menos abundantes que en alimentos, tal y como ha quedado de manifiesto en la literatura científica, en varios informes realizados por las instituciones sanitarias europeas, y por las numerosas solicitudes para la aportación de datos realizada a los Estados miembros por parte de la Comisión Europea. Conscientes de la problemática actual, el primer objetivo de esta Tesis Doctoral se dirige a la optimización y validación de métodos analíticos basados en cromatografía líquida para la determinación de las principales micotoxinas actualmente legisladas en piensos. Para el desarrollo de dicha metodología se ha teniendo en cuenta los criterios de calidad aceptados y aplicables a métodos de ensayo, los criterios específicos establecidos para métodos de ensayo para el control de micotoxinas en alimentos establecidos en la legislación europea, y su posible transferencia práctica a laboratorios de control. Dado que habitualmente, los recursos humanos y materiales de los laboratorios de control de micotoxinas son limitados, la selección del equipamiento, materiales y reactivos se ha realizado teniendo también en cuenta su viabilidad económica. Durante los últimos años el uso de la espectrometría de masas en métodos de ensayo aplicados a la determinación de micotoxinas en alimentos ha tenido un gran desarrollo debido a su sensibilidad, reproducibilidad y su capacidad de determinar, en un único análisis, un importante número de micotoxinas diferentes químicamente. En piensos, sin embargo, el desarrollo de la citada metodología ha sido más limitado. Por ello, y como segundo y tercer objetivos, se ha desarrollado y validado un método analítico que combina dos de las técnicas de detección que más desarrollo están teniendo actualmente, la espectrometría de masas acoplada en tándem y la espectrometría de tiempo de vuelo, que supone un enfoque novedoso en la determinación del nivel de contaminación de micotoxinas en piensos. Mediante el uso de la espectrometría de masas en tándem, el método analítico desarrollado permite la cuantificación, ajustada a los actuales límites de concentración establecidos en la legislación, de las principales micotoxinas reguladas en piensos, y la inclusión de otras posibles micotoxinas que pudieran establecerse en un futuro. De forma complementaria, y mediante el uso de la técnica espectrométrica cuadrupolo tiempo de vuelo, el método desarrollado permite la identificación de 245 posibles micotoxinas y otros metabolitos fúngicos o bacterianos presentes en las muestras, permitiendo obtener una visión más completa del nivel de contaminación por micotoxinas presentes en las muestras. Al igual que la metodología de rutina desarrollada comentada en el apartado anterior, este método también se ha desarrollado y validado cumpliendo los criterios generales de calidad y específicos para métodos de ensayo de micotoxinas, comúnmente aceptados internacionalmente y establecidos en la legislación europea. Como objetivo cuarto de esta Tesis Doctoral, se ha aplicado toda la metodología analítica desarrollada en los objetivos anteriores al análisis de un conjunto de 62 muestras comerciales de piensos, seleccionadas en función de los distintos tipos de piensos comerciales actualmente existentes en el mercado español ganadero con el objeto de conocer su grado de contaminación con micotoxinas. Finalmente, el quinto objetivo de la Tesis se dirige al estudio de la micobiota potencialmente productora de las micotoxinas encontradas en las muestras de piensos analizadas en el objetivo cuarto. Se emplean para ello métodos convencionales basados en el estudio de la morfología macro- y microscópica de los hongos y métodos de PCR específicos de especie basados en regiones multicopia. Los resultados obtenidos indican que, en general, existe una fuerte correlación entre la presencia de micotoxinas en muestras y la presencia de especies productoras de las mismas. Las especies fúngicas más destacables y frecuentes han sido Aspergillus flavus, Aspergillus spp. del agregado niger, A. ochraceus, F. proliferatum, F. verticillioides y F. graminearum. En su conjunto, el trabajo de investigación realizado permite disponer de una metodología analítica optimizada, transferible y de fácil implementación en laboratorios de control de micotoxinas en piensos. A través del método combinado basado en espectrometría de masas, se ha desarrollado y optimizado una metodología novedosa para la cuantificación de las principales micotoxinas recogidas en la legislación y la identificación de otras posibles presentes en piensos. Finalmente y mediante la aplicación de la metodología analítica desarrollada en combinación con el estudio de la posible micobiota toxigénica presente en las muestras de piensos, se han recopilado un conjunto de datos que puede servir como punto de partida para futuros trabajos de investigación relacionados con las interacciones de los distintos factores que afectan al crecimiento fúngico en piensos y sus materias primas, la posible producción posterior de micotoxinas, y el diseño de medidas preventivas del crecimiento fúngico y producción de micotoxinas a lo largo de la cadena alimentaria animal, y en definitiva, una menor exposición de la población, tanto humana como animal a estos metabolitos tóxicos de origen fúngico.