Estudio de la heterogeneidad fenotípica del sarcoma de ewing (se) en xenotrasplantes derivados de pacientes (pdx)

Resumen

Los Tumores de la Familia del Sarcoma de Ewing (TFSE) son neoplasias malignas de hueso y de partes blandas, poco frecuentes (entre el 6-8% de los tumores malignos primarios de hueso) y que afectan principalmente a pacientes en edad de crecimiento, adolescentes y adultos jóvenes (1, 2). El término engloba a tres tumores que durante años han sido considerados por separado por su morfología característica, pero que forman un espectro morfológico, de biología e histogénesis comunes (3). Dichos tumores son los Sarcomas de Ewing clásicos, los atípicos y los tumores neuroectodérmicos primitivos periféricos (PNET). Desde el punto de vista morfológico son neoplasias constituidas por células pequeñas, redondas y azules, de núcleos densos y escaso citoplasma, pudiendo ser éste eosinófilo o claro, debido a la presencia de glucógeno PAS+. Ocasionalmente muestra rosetas neuroectodérmicas o variantes morfológicas atípicas, con células de mayor tamaño, desmoplasia, patrón hemangiopericítico, etc. La característica genética del SE es la translocación recíproca t (11; 22) (q24; q12), resultando en la fusión de los genes EWSR1 y FLI1, identificados en el 90% de los casos (8). La segunda anomalía molecular más común es la t (21; 22) (q22; q12), que fusiona los genes EWSR1 y ERG presente en el 5% de los casos (9). Solo un pequeño porcentaje de SE muestra fusiones de EWSR1 con otros miembros de la familia de factores de transcripción (ETS), como ETV1 (7p22) (10), E1A-F (17q21) (11) y FEV (2q35 - 36) (12). El diagnóstico de los TFSE es en ocasiones complicado, por tanto, para su diagnóstico, no sólo una morfología característica sino un panel amplio de marcadores inmunohistoquímicos y estudio molecular. En la actualidad no existe un anticuerpo específico de SE aunque se han postulado como los más característicos: CD99, CAV-1, FLI1, HNK1 y ERG (el subtipo c-terminal) (27) Existen numerosas vías de señalización alteradas en el sarcoma de Ewing, por un lado la pérdida de factores que inhiben la proliferación por distintas vías (por ejemplo CDKN2A (p16) y TP53) y por otro, la sobreexpresión de receptores de membrana, con función tirosinquinasa, que dan lugar a la proliferación descontrolada de estos sarcomas (principalmente cKIT e IGF1R) (54). Conocer estas vías de señalización resulta clave para avanzar en el tratamiento de estas neoplasias. Para ello se propone estudiar factores reguladores tanto de la apoptosis, como de la proliferación, en una serie de SE, generando xenotrasplantes derivados de pacientes. A la vez que validamos una experiencia in vivo y estudiamos la biología de estos tumores en esta plataforma animal experimental. Las principales moléculas implicadas en el mecanismo de anti-apoptosis en los TFSE son BCL2, caspasa 8 y el receptor del factor de crecimiento insulínico 1 (IGF1R). Asimismo estudiaremos moléculas que permitan al SE interactuar con el mesénquima circundante y avanzar; hemos seleccionado Ezrina, por estar relacionada con las metástasis y un pronóstico desfavorable en sarcomas de alto grado, como osteosarcomas, los sarcomas de Ewing metastásicos y los sarcomas indiferenciados de alto grado (67). Así como SIRT1 o sirtuina1, cuya expresión nuclear en los TFSE, se ha observado en aquellos casos metastásicos de inicio y en las metástasis con respecto a sus tumores originales (78). SIRT1 interviene junto con LSD1 en el control de la expresión de determinados genes entre ellos HEY, participando en la inactivación de p53. (78). Su inactivación ofrece, por tanto opciones terapéuticas en esos tumores (79) dado que se han identificado inhibidores de LSD1 (HCI-2509), permitiendo modificar todos los perfiles transcripcionales promovidos por EWSR1-FLI y EWSR1-ERG y retrasar significativamente la tumorigénesis in vivo (84). La vía de señalización IGF1-R/PI3K/AKT/mTOR es una de las principales en el SE, que regula múltiples funciones celulares manteniendo la proliferación celular, previniendo la apoptosis y aumentando la angiogénesis (85). Además, la producción de IGF1 por el estroma ha sido relacionada con la interacción de las células tumorales con el ambiente, aumentando su capacidad de invasión y metástasis. El bloqueo de esta vía de señales ha ampliado el abanico de opciones terapéuticas en el SE (86-89). Pueden ser estudiadas por inmunohistoquímica (85) lo que ha permitido determinar su valor pronóstico. ERBB4 es un receptor de membrana de la familia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), cuya sobreexpresión de ERBB4 favorece la invasión y el crecimiento y su bloqueo, reduce significativamente la aparición de metástasis in vivo. Su expresión no ha sido evaluada hasta la fecha, en los SE. FOXO1 FOXO1 pertenece al grupo de factores de transcripción Forkhead box O (98). Se ha descrito como un gen supresor tumoral, promoviendo la apoptosis y bloqueando la actividad de las quinasas dependientes de ciclinas (99) . La fusión EWSR1-FLI1 interfiere en la expresión de algunos genes, entre ellos FOXO1 (100) , de manera que reduce su expresión y por tanto reduce la apoptosis. Se ha visto que el bloqueo de EWS-FLI1 con RNA de interferencia (siRNA) aumenta la expresión de FOXO1 y disminuye la proliferación de las células (101). Existe en el SE otras vías de inactivación de FOXO 1, a nivel proteico, por la degradación de la proteína en el núcleo. Esta degradación está favorecida por una vía PI3K/AKT activa y por la desacetilasas como SIRT1, ambas vías activas en los SE. Reparación del ADN PARP1 Poli (ADP-ribosa) polimerasa, enzima reguladora implicada en la transcripción y reparación del ADN (103), se ha estudiado tanto en neoplasias sólidas, fundamentalmente en el cáncer de mama BRCA1 mutado (104) y triple negativos (105), como en el cáncer de próstata (106), en el neuroblastoma (107), en gliomas (108), melanomas (109) y en el sarcoma de Ewing (109-112). La reparación del ADN a través de mecanismos que implican roturas de la doble cadena del ADN, como la recombinación homóloga, está muy inhibida en los carcinomas sólidos con mutación en BCRA1 o en BCRA2. Estas células compensan el déficit de reparación del ADN mediante la sobreactivación de PARP, cuya capacidad de reparación del ADN ocurre a través de la rotura simple de una sola cadena (104) . Los inhibidores de PARP bloquean este mecanismo y favorecen que, de una manera selectiva, la célula cancerosa entre en apoptosis al no poder reparar el ADN de ninguna de las maneras (110) . En el SE, el defecto es diferente (111) . No se ha visto un defecto de reparación en el ADN, sino una hipersensibilidad a los complejos ADN-PARP que impiden a la célula entrar en apoptosis. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se ha demostrado en cultivos que las células que expresan estas proteínas quiméricas muestran un reducido crecimiento cuando son tratadas con Olaparib (potente inhibidor de PARP1 y PARP2); algo que no ocurre en las líneas celulares de osteosarcoma (SAOS-2) ni de rabdomiosarcoma (A-204). Olaparib asociado a la quimioterapia convencional utilizada en el SE, reduce significativamente el crecimiento tumoral in vitro, frente a cualquiera de los dos de forma aislada (114). SA2 Forma parte de las cohesinas, un complejo de proteínas encargadas de la unión y separación de las cromátides hermanas en la mitosis, a la vez que participan organizando la interfase (115). Concretamente SA2 participa en la separación de los centrómeros (116). Se ha descrito que la inactivación de SA2 provoca aneuploidía en el cáncer humano (118). Recientemente se ha estudiado el papel de SA2 en cáncer de mama, observándose que la disminución de la inmunoexpresión se asocia con enfermedad mamaria maligna y un curso particularmente desfavorable (119). En los SE se ha estudiado el estado mutacional de SA2 y su correlación con la expresión inmunohistoquímica de la proteína (120). El estudio revela que cuando existe mutación del gen la proteína no se expresa, hecho que ocurre fundamentalmente en tumores de estadios avanzados. La expresión de la proteína en el tiempo y en distintas situaciones clínicas no ha sido estudiada. p53 La proteína p53 está codificada por el gen TP53 (considerado el guardián del genoma) y es la responsable de impedir el crecimiento celular e inducir apoptosis. TP53 está alterado entre el 5% y el 20% de los TFSE según las series; tanto en forma de mutación puntual, como de deleción (126, 129) y su pérdida de función ha sido definida como una de las responsables de la progresión de estas neoplasias (129-131). No obstante, p53 no se considera un marcador pronóstico estable, dado que los resultados en las series han sido contradictorios (58, 125, 130, 132); no demostrándose diferencias significativas en las grandes series, entre presencia o no de mutación y evolución clínica adversa (58, 132). Hasta la fecha no se ha estudiado el cambio de expresión y/o de estatus mutacional en el tiempo; así como tampoco la persistencia o cambio de dicho estado en las recidivas o metástasis con respecto al tumor original. Ki67 El índice de proliferación Ki67 (o MIB-1) es un marcador que define las células que están en forma activa en ciclo y se están replicando. En los TFSE se ha descrito una expresión variable e irregular según las series (132, 133); a la vez que se ha definido como factor pronóstico independiente en los casos de SE inicialmente localizado, de supervivencia libre de enfermedad (SLE) y de supervivencia global (SG). Así mismo, se ha asociado a factor pronóstico los subtipos de fusión entre los genes EWSR1 y los distintos factores de transcripción de la familia de ETS. La fusión tipo 1 que une el exón 7 del gen EWSR1 con el exón 6 del gen FLI es, la más frecuente y la de mejor pronóstico, asociándose a un menor grado de expresión de Ki67 (134). Sigue sin definirse en la actualidad un porcentaje de expresión de Ki67 que prediga qué casos van a ir peor y sea de utilidad en el diagnóstico diario. YB-1 La proteína de unión Y-Box 1 (YB-1) está codificada por el gen YBX1 y participa en la transcripción del ADN, en el procesamiento del ARN y en la traducción del mismo (139, 140). YB-1 juega un papel importante como oncogen en la invasión celular y en la resistencia a la quimioterapia (141, 142); así como activando aquellos genes relacionados con la transición epitelio-mesénquima, como los factores de transcripción Snail y Twist (141) y activando la vía AKT/ mTOR y por tanto, con la capacidad infiltrativa de estas neoplasias (143) ). En los sarcomas se ha demostrado que la expresión de YB-1, tanto en cultivos celulares como en xenotrasplantes, se relaciona con una mayor capacidad metastásica (144). De tal forma que si se bloquea la expresión de YB1 (YB1 Knock-down) el tumor crece, pero no metastatiza. BRAF BRAF es un oncogén crítico para la proliferación y supervivencia de las células del melanoma a través de la activación de la vía RAF /MEK / ERK de la vía de las quinasas activadoras de la mitosis (MAPK) (163, 164), siendo un objetivo atractivo para la terapia anti-melanoma. Estudios recientes revelan que más de la mitad de los melanomas presentan una mutación activante en el amino ácido V600 del gen BRAF (BRAF V600E) (165). Existen inhibidores específicos de la mutación y otros por debajo de la señalización de BRAF capaces de bloquear dicha mutación y sus efectores (inhibidores de MEK) como son RAF-265 (Novartis), XL281 (Exelixis), PLX4032 (Plexxikon/Roche) y GSK2118436 (GSK). Estos inhibidores están siendo utilizados en ensayos clínicos en enfermedad avanzada (160). La mutación de BRAF y consecuentemente su sobreexpresión, no ha sido extensamente estudiada en el SE, siendo su expresión baja en la única serie publicada (166). Es interesante por tanto estudiar su expresión en nuestros casos, no sólo de forma estática, sino dinámica en el tiempo. En la actualidad, un tercio de los SE presentan metástasis al diagnóstico; siendo por tanto su pronóstico malo, sin haberse encontrado mejoría en los últimos 30 años a pesar de haberse identificado nuevas dianas terapéuticas y existir abundantes estudios al respecto. Tampoco somos capaces de predecir qué tumores inicialmente localizados van a ser mejor respondedores al tratamiento adyuvante, ni cuáles van a progresar a pesar del tratamiento. En la actualidad se estima que hasta un 30% de estos pacientes con enfermedad localizada evolucionan mal (167). Así mismo, sigue siendo todavía una incógnita, tanto el origen del tumor, como su desigual evolución en los diferentes pacientes. Es necesario, por tanto, realizar un estudio de la heterogeneidad tanto morfológica como fenotípica, en el origen y en la evolución en el tiempo, con vistas a determinar cambios en la biología, genética y epigenética tumorales y poder realizar una medicina personalizada en cada paciente. Los modelos de injertos de tumores en animales proporcionan una plataforma experimental valiosa, que permiten, evaluar la morfología tridimensional de una neoplasia poco frecuente (177), su relación con el componente estromal (178), la angiogénesis (179), el potencial invasivo o la capacidad metastásica. Además de permitir la caracterización de neoplasias mediante diversos procedimientos como histopatología, inmunohistoquímica (IHC) (180-182), microscopía electrónica (EM), citogenética (hibridación convencional y fluorescente in situ (FISH) (183, 184), la biología molecular y la expresión génica (185), no sólo de la neoplasia original, sino también de los pasajes posteriores del tumor debido a la buena preservación de la morfología a lo largo de las generaciones (179-181).Los ratones desnudos atímicos (nu/nu) se caracterizan por tener un deficiente sistema inmune, por lo que han sido ampliamente utilizados para crecer en ellos tumores derivados de pacientes (186). Existe en nuestro grupo una amplia experiencia en utilización de ratones atímicos en la investigación de sarcomas (178, 179, 181, 186-190). La tecnología de micromatrices de tejidos (TMA) permite la evaluación de histopatología e IHC en una gran cohorte de tumores en una sola laminilla, ahorrando costes, tiempo y fundamentalmente tejido. La combinación de modelos de xenoinjerto de SE, incluyendo generaciones sucesivas de pases de ratones en combinación con la tecnología TMA, no se ha informado hasta ahora. Por tanto, nos hemos planteado la siguiente hipótesis y objetivos: Hipótesis de trabajo La hipótesis de trabajo que se pretende demostrar es que existen diferencias fenotípicas en el sarcoma de Ewing que justifican una diferente evolución en el paciente. Objetivos Objetivo general 1. Caracterizar in vivo, una serie de TFSE tanto en su forma original, como a lo largo de los pases una vez xenotransplantados, para detectar posibles cambios en la expresión proteica de marcadores biológicos, que puedan justificar la heterogeneidad de comportamiento clínico y su evolución. Objetivos específicos 1. Caracterizar in vivo una serie de TFSE, tanto en su forma original como a lo largo de los pases una vez xenotransplantados, para detectar posibles cambios en su morfología. 2. Validar una plataforma experimental animal y estudiar la biología tumoral en ratones atímicos. 3. Estudiar la presencia de metástasis realizando el estudio autópsico de cada uno de los animales. 4. Estudiar los principales marcadores inmunohistoquímicos disponibles para el diagnóstico de los TFSE, así como su validez en los distintos subtipos histológicos y a lo largo de los pases. 5. Estudiar la expresión de marcadores biológicos y vías de señalización de relevancia en el SE. 6. Evaluar las diferencias de expresión en tumores inicialmente localizados y metastásicos para detectar posibles diferencias fenotípicas que justifiquen una distinta agresividad clínica entre ambos. 7. Evaluar el cambio de expresión de los marcadores en los distintos pases. 8. Detectar cambios en el fenotipo de un tumor con respecto a sus metástasis. 9. Validación in sílico de marcadores diferencialmente expresados en distintas formas clínicas de SE o con variación a lo largo de los pases.