Estrés oxidatiu, òxid nítric i activitat plaquetar en el malalt d'hipertensió arterial

Resumen

En moltes reaccions de les cèl¿lules es produeixen radicals lliures com a subproductes, per exemple, el radical superòxid generat en la cadena respiratòria. Tanmateix, el superòxid pot reaccionar amb espècies diferents, com l'òxid nítric, produint-se peroxinitrit (ONOO-), o pot convertir-se en peròxid d'hidrogen i este pot reaccionar amb altres espècies o molècules. Este és un exemple de reacció en cadena que pot ocórrer en la cèl¿lula. Per poder defensar-se d'estes espècies reactives, la cèl¿lula té enzims i sistemes antioxidants, com per exemple, la superòxid dismutasa, la glutatió peroxidasa 1 o el sistema glutatió. El desequilibri entre estos dos grans grups de reaccions cap a la formació de radicals lliures és el que s'anomena estrès oxidatiu. La hipertensió arterial (HTA) és una malaltia comú que afecta a més del 25% de la població adulta, una proporció que augmenta amb l'edat, i varia entre els diferents grups ètnic-racials. És un dels principals factors de risc càrdio-vascular i renal, i nombrosos estudis confirmen el benefici de la reducció de la pressió sanguínia [1-3]. Existeixen múltiples causes conegudes de la hipertensió, algunes de les quals eleven només la pressió sistòlica i altres les pressions diastòlica i sistòlica a la vegada. Tot i això, el 95% dels pacients hipertensos pateixen l'anomenada hipertensió arterial essencial (HTAe) o de causa desconeguda. Este terme recull probablement diverses formes d'hipertensió que podrien ser identificades en el futur. La hipertensió es pot considerar com un estat d'estrès oxidatiu, que pot contribuir al desenvolupament d'aterosclerosi i a produir lesions del anomenats òrgans diana. Una excessiva producció d'espècies reactives d'oxigen, afegit a una reducció en les activitats antioxidants, es relaciona amb les condicions fisiopatològiques que danyen el sistema càrdio-vascular [4]. En HTA també existeix dany endotelial, a part del causat per l'estrès oxidatiu, per altres factors com, per exemple, el major efecte cisalla, degut a l'augment de la pressió arterial i de la viscositat. En eixes condicions, es va a produir una major oxidació de les lipoproteïnes de baixa densitat (LDL), el que també comporta un augment en el risc aterogènic. Per altra banda, este dany endotelial pot traduir-se en una disminució de la producció o en la biodisponibilitat del NO endotelial i plaquetari i una major susceptibilitat a la formació de plaques aterogèniques. En 1987, es va demostrar que l'òxid nítric és el factor de relaxació derivat de l'endoteli [5], Posteriorment, s'ha demostrat que juga el paper central en el control de l'homeòstasi vascular. A més, no sols modula el to vasomotor, sinó que també influeix sobre molts factors plaquetaris i endotelials, preveu la propagació de l'oxidació lipídica, inhibeix la proliferació de les cèl¿lules vascular del múscul llis, i disminueix l'agregació plaquetària [6]. Estes representen alguns dels primers passos en la formació de la lesió arterioscleròtica. Estes propietats antiateroscleròtiques de l'NO són molt rellevants per a les malalties humanes, ja que quasi tots els factors de risc per a l'arteriosclerosi, com son la hipercolesterolèmia, diabetis, resistència a la insulina, hipertensió i el fumar redueixen, la producció endotelial de l'NO [6]. Per altra banda, l'NO és un radical lliure, al tindre un electró despariat en la seua capa de valència, i per tant, pot participar en reaccions redox diferents. Algunes d'estes reaccions poden augmentar les seues funcions biològiques, mentre que altres poden limitar la seua funció [7]. Degut a que el desenvolupament de la lesió càrdio-vascular implica trombosi, és lògic pensar que hi ha una relació entre la hipertensió i l'activació plaquetària. La presència d'agregats plaquetaris, ben coneguda en la hipertensió [8], és un factor important en la implicació de les plaquetes en la hipertensió, predient l'oclusió vascular [9]. Este estudi forma part d'un estudi més ampli on es confirma que pacients d'hipertensió arterial essencial posseeixen un augment significatiu dels marcadors d'estrès oxidatiu, així com una disminució de l'activitat dels enzims antioxidants que el protegeixen front a este [10]. Per altra banda, està demostrat que la reducció de les xifres tensionals d'estos pacients comporta una disminució dels productes d'oxidació, així com una milloria en les seues activitats antioxidants [11]. Més recentment, hem vist que una resposta inadequada dels enzims citoplasmàtics en les cèl¿lules mononuclears a l'estrès oxidatiu pot contribuir a l'estrès oxidatiu present en la HTAe [12]. HIPÒTESI DE TREBALL La hipòtesi d'este treball es fonamenta en que la disminució de l'estrès oxidatiu demostrat després del tractament antihipertensiu en cèl¿lules mononuclears, plasma i orina [10, 12, 13], s'ha de veure reflectit en la disminució de radicals superòxid i peròxids tant en les poblacions leucocitàries com en les plaquetes de pacients amb hipertensió arterial després del tractament antihipertensiu. A més a més, que existeix una relació entre el grau d'estrès oxidatiu, activitat de l'òxid nítric i activació plaquetària. Totes estes relacions poden comprovar-se pels canvis que es produeixen en els paràmetres esmentats al llarg del tractament antihipertensiu. OBJECTIUS El present estudi té els següents objectius: 1.- Estudiar la presència de radicals superòxid i peròxids en les poblacions leucocitàries i plaquetes de pacients hipertensos, en absència i després de tres i dotze mesos de tractament antihipertensiu, i la seua implicació en l'estat d'estrès oxidatiu que presenten estos pacients. 2.- Estudiar la presència d'òxid nítric en plaquetes de pacients hipertensos, en absència i després de tres i dotze mesos de tractament antihipertensiu, i la seua implicació en l'activitat plaquetària d'estos pacients. 3.- Estudiar la relació entre els nivells d'espècies reactives d'oxigen, l'òxid nítric i l'activitat plaquetària, estimada mitjançant l'expressió de P-selectina i gpllb/llla després de les seues exposicions a l'ADP, en pacients hipertensos, en absència i després de tres i dotze mesos de tractament antihipertensiu. METODOLOGÍA El present treball és un estudi de cas i control entre els normotensos i els hipertensos. També és un estudi de cas i control entre els hipertensos sense i després de tres i dotze mesos de tractament. En cada moment de l'estudi s'ha mesurat els marcadors bioquímics relacionats amb l'estrès oxidatiu: glutatió reduït (GSH), glutatió oxidat (GSSG), malondialdehid (MDA), la base modificada 7,8-dihidro-8-oxo-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) en ADN nuclear i ADN mitocondrial i proteïnes carbonilades de cèl¿lules mononuclears; 8-oxo-dG en orina; poder reductor total (PAO) i nitrats i nitrits en plasma. Per estudiar la resposta an8tioxidant s'han mesurat les activitats dels enzims catalasa, glutatió peroxidasa-1 (GPx1), glutatió reductasa (GR), les activitats superòxid dismutasa (SOD) i s'ha mesurat la quantitat de proteïna de la Cu,Zn-SOD. També s'ha mesurat els radicals superòxid i peròxids i l'òxid nítric en les poblacions leucocitàries i plaquetes. I, per últim, també s'ha mesurat l'activitat plaquetària mitjançant els marcadors P-selectina i gpllb/llla. Els nivells de GSH [14], GSSG [15] i MDA [16], després de la seua extracció, han segut determinats per cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC), a partir de les cèl¿lules mononuclears aïllades de la sang, tant de pacients amb hipertensió, com dels controls. L'ADN nuclear s'aïllà seguint el mètode Gupta, amb les modificacions descrites en Muñiz et al [17], on la mescla de cloroform:alcohol isoamílic (24:1) substitueix al fenol en l'etapa d'eliminació de proteïnes. L'ADN mitocondrial s'aïlla segons el mètode de Latorre et al [18]. L'assaig de la 8-oxo-dG es determina mitjançant cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) [19]. L'assaig de la 8-oxo-dG urinària es realitza en orina de la primera hora del matí. El mètode de la detecció de la 8-oxo-dG urinària està basat en el mètode descrit en [20, 21]. La mesura de les proteïnes carbonilades es realitza mitjançant ELISA, segons [22]. El kit de ELISA que s'ha utilitzat per a mesurar el PAO, en plasma en les diferents extraccions de sang, és fabricat per la companyia Deltaclon Oxistress i la referència és DEL 001. El kit de ELISA que s'ha utilitzat per a mesurar el nivells de nitrats i nitrits, en plasma en les diferents extraccions de sang, és fabricat per la companyia BioVision Research Products i la referència és #K262-200. La determinació de l'activitat catalasa es du a terme mitjançant un assaig espectrofotomètric (BIOXYTECH, Catalasa-520, número del catàleg 21042). Les activitats SOD es van realitzar mitjançant espectrofotometria, i la quantificació de la proteïna Cu,Zn-SOD mitjançant western blot. La determinació de l'activitat GPx1 es du a terme mitjançant un assaig colorimètric (BIOXYTECH GPx-340, número del catàleg 21017), el qual és una mesura indirecta de l'activitat GPx1 [23]. La determinació de l'activitat GR es va realitzar amb un assaig espectrofotomètric (BIOXYTECH GR-340, número del catàleg 21018D). Les mesures dels radicals superòxid i peròxids i l'òxid nítric en les poblacions leucocitàries i plaquetes han segut realitzats per citometria de flux i reactius específics per a cada espècie. Les mesura de l'activitat plaquetària s'ha realitzat mitjançant citometria de flux i utilitzant anticossos específics de la P-selectina i la forma activada de la gpllb/llla, estudiant l'estat basal dels pacients i després d'un estímul amb l'agonista ADP. BIBLIOGRAFIA BÀSICA 1. Hansson, L., The Hypertension Optimal Treatment study and the importance of lowering blood pressure. J Hypertens Suppl, 1999. 17(1): p. S9-13. 2. Kannel, W.B., et al., Components of blood pressure and risk of atherothrombotic brain infarction: the Framingham study. Stroke, 1976. 7(4): p. 327-31. 3. O'Donnell, C.J., et al., Hypertension and borderline isolated systolic hypertension increase risks of cardiovascular disease and mortality in male physicians. Circulation, 1997. 95(5): p. 1132-7. 4. Ferroni, P.B., S Paoletti, V Davi, G, Endothelial dysfunction and oxidative stress an arterial hypertension. Nutricion, Metabolism&Cardiovascular Diseases, 2006. 16(222-233). 5. Palmer, R.F., AJ Moncada, S, Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature, 1987. 327: p. 524-526. 6. Cai, H. and D.G. Harrison, Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the role of oxidant stress. Circ Res, 2000. 87(10): p. 840-4. 7. Loscalzo, J., Nitric oxide insufficiency, platelet activation, and arterial thrombosis. Circ Res, 2001. 88(8): p. 756-62. 8. Pravenec, M., et al., Platelet aggregation in spontaneous hypertension: genetic determination and correlation analysis. J Hypertens, 1992. 10(12): p. 1453-6. 9. Dockrell, M.E., et al., Platelet aggregation in young men with contrasting predisposition to high blood pressure. Am J Hypertens, 1999. 12(2 Pt 1): p. 115-9. 10. Redon, J., et al., Antioxidant activities and oxidative stress byproducts in human hypertension. Hypertension, 2003. 41(5): p. 1096-101. 11. Sáez, G.e.a., Factors related to the Impact of Antihypertensive Treatment in Antioxidant Activities and Oxidative Stress By-products in Human Hypertension. Am J Hypertens, 2004. 17: p. 809-816. 12. Chaves, F.J., et al., Inadequate cytoplasmic antioxidant enzymes response contributes to the oxidative stress in human hypertension. Am J Hypertens, 2007. 20(1): p. 62-9. 13. Saez, G.T., et al., Factors related to the impact of antihypertensive treatment in antioxidant activities and oxidative stress by-products in human hypertension. Am J Hypertens, 2004. 17(9): p. 809-16. 14. Brigelius, R., et al., Identification and quantitation of glutathione in hepatic protein mixed disulfides and its relationship to glutathione disulfide. Biochem Pharmacol, 1983. 32(17): p. 2529-34. 15. Navarro, J., et al., Blood glutathione as an index of radiation-induced oxidative stress in mice and humans. Free Radie Biol Med, 1997. 22(7): p. 1203-9. 16. Wong, S.H., et al., Lipoperoxides in plasma as measured by liquid-chromatographic separation of malondialdehyde-thiobarbituric acid adduct. Clin Chem, 1987. 33(2 Pt 1): p. 214-20. 17. Muniz, P., et al., The role of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rifamycin-induced DNA damage. Free Radie Biol Med, 1995. 18(4): p. 747-55. 18. Latorre, A., A. Moya, and F.J. Ayala, Evolution of mitochondrial DNA in Drosophila subobscura. Proc Nati Acad Sci USA, 1986. 83(22): p. 8649-8653. 19. Muniz, P., et al., Age-related changes of liver antioxidant enzymes and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine during fetal-neonate transition and early rat development. IUBMB Life, 2000. 49(6): p. 497-500. 20. Shigenaga, M.K. and B.N. Ames, Assays for 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine: a biomarker of in vivo oxidative DNA damage. Free Radic Biol Med, 1991. 10(3-4): p. 211-6. 21. Brown, R.K., et al., Oxidative damage to DNA in patients with cystic fibrosis. Free Radic Biol Med, 1995. 18(4): p. 801-6. 22. Buss, H., et al., Protein carbonyl measurement by a sensitive ELISA method. Free Radic Biol Med, 1997. 23(3): p. 361-6. 23. Paglia, D.E. and W.N. Valentine, Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med, 1967. 70(1): p. 158-69.