Estudio del perfil circulante de micrornas en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina. Implicaciones diagnósticas, pronósticas y terapéuticas

Resumen

El déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) es una condición genética rara y hereditaria que conduce a la disminución de los niveles circulantes de alfa-1 antitripsina, aumentando significativamente el riesgo de padecer enfermedad pulmonar y hepática grave, en niños y adultos. Esta condición tiene una gran variabilidad, tanto genética como clínica, lo que dificulta su pronóstico. Los microRNAs son unas pequeñas moléculas alrededor de 22nt cuya función es la regulación de la expresión génica. Además, estas moléculas tienen gran potencial como biomarcadores por su localización en fluidos corporales, como la sangre, provenientes de órganos altamente vascularizados, incluyendo pulmones e hígado; son muy estables ya que la mayoría se encuentran unidos a proteínas AGO y su cantidad varía en condiciones patogénicas, pudiendo variar su expresión antes de la aparición de la sintomatología clínica. Nuestro objetivo es encontrar una firma de microRNAs circulantes que puedan discriminar entre los diferentes fenotipos, comportándose como biomarcadores diagnósticos y, si desarrollaran enfermedad pulmonar o hepática, como biomarcadores pronósticos. El perfil de expresión de los miRNAs plasmáticos se realizó mediante microarray (geneChip 3.0, Affymetrix), en 56 sujetos donde se incluyen pacientes con DAAT y fenotipos MS, MZ, SZ y ZZ que no habían desarrollado patología (ni pulmonar, ni hepática); pacientes con DAAT y enfermedad (tanto enfisema como hepatopatía) y sujetos control sanos (MM). Los miRNAs que presentaban diferencias estadísticamente significativas en algún análisis de los arrays se validaron mediante RT-qPCR. Además, con estos resultados, se llevó a cabo un análisis de enriquecimiento funcional, con el que se obtiene información sobre las funciones que están diferencialmente representadas en los diferentes grupos del estudio. La extracción del RNA se realizó con el kit miRVANA parís (Ambion). Los microRNAs seleccionados se validaron mediante RT-qPCR. La transcripción reversa de los miRNAs expresados diferencialmente se realizó usando TaqMan Advance miRNA cDNA synthesis kit (Applied biosystem), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este nuevo kit permite realizar una única retrotranscripción para todo el conjunto de microRNAs, siendo posible gracias a la adicción de una cola poli-A en el extremo 3’ y un adaptador en el extremo 5’ de cada uno de los microRNAs, pudiéndose amplificar así con unos primers universales. La expresión de cada uno de los miRNAs se determinó mediante PCR cuantitativa a tiempo real, utilizando primers y sondas TaqMan específicos para cada miRNA. Cada muestra se analizó por duplicado, y la expresión de cada miRNA se determinó por el método 2-ΔCt. Para cada uno de los miRNAs validados se comprobó si alguna de las co-varibles (edad y sexo) era estadísticamente significativa mediante tests multivariantes. En el caso de que no lo fueran, se procedió al análisis univariante de los datos con el test no paramétrico de Kruskal-Wallis, debido a diferencia de muestra entre los grupos; para los tests post hoc se utilizó Dunn. Los análisis estadísticos se realizaron con los software Graph Pad Prism 6.0, SPSS, versión 22 y R. La firma de microRNAs circulantes varía en pacientes con déficit de alfa-1 antitripsina, lo que podría ser útil para el diagnóstico. El miR-122 disminuye con la edad y con el DAAT. Este miR es principalmente hepático, donde representa la mitad del miRnoma y está implicado en la regulación de iones de cobre y hierro, glúcidos y lípidos. Además, el miR-93 está incrementado en los pacientes deficitarios. El miR-107 está más elevado en mujeres y aumenta con la presencia del alelo PiZ. También los miR-425 y 151a aumentan su expresión con el alelo PiZ, pero siendo mayor en homocigosis. El miR-151a inhibe el complejo ubiquitina ligasa cul7-RING, a través del gen SKP1 que forma parte del sistema ubiquitina-proteasoma cuya función es regular la degradación de las proteínas. Se han encontrado resultados prometedores para el uso de los microRNAs como biomarcadores pronósticos del DAAT pero son datos que habría tomar con cautela a la espera de su validación con una cohorte más grande de pacientes. Existen 3 microRNAs (17, 106a y 93) que están elevados en los pacientes con enfisema pulmonar. Los 3 podrían ser buenos biomarcadores ya que, en todos los casos, su área bajo de la curva es mayor de 0,8. Los análisis funcionales muestran que estos miRNAs regulan el desarrollo pulmonar, el estrés oxidativo y el sistema inmune. Esto apoya la teoría de que la EPOC se desarrolla, principalmente, por el desequilibrio proteasa-antiproteasa, la inflamación y el estrés oxidativo. Además, Los miR-107 y 23b están incrementados en pacientes con hepatopatía. Ambos microRNAs serían buenos biomarcadores de enfermedad hepática, ya que el área bajo de la curva de ambos es mayor de 0,8, mientras que el miR-23b alcanza el 100% de sensibilidad y especificidad.