Analysis of mirnas in endometrial fluid as a tool for non-invasive diagnosis of endometrial receptivity

Resumen

INTRODUCCIÓN La implantación embrionaria es el proceso por el que el embrión humano en fase de blastocisto se adhiere al útero materno para comenzar la gestación. El endometrio, la mucosa uterina solo puede aceptar al embrión en un momento determinado del ciclo menstrual que puede variar entre 12 horas y 2 días, identificado como "ventana de implantación". Desde siempre se ha buscado la forma de identificar de forma fiable dicha ventana utilizando técnicas histológicas, como los criterios de Noyes, a través de la observación morfológica vía ecográfica, o estudiando los cambios en los perfiles transcriptómicos, proteómicos o metabolómicos. No obstante, en reproducción asistida, se está abriendo el camino a un nuevo tipo de diagnóstico que ve como protagonista el líquido endometrial, en el cual están presentes moléculas secretadas por el epitelio luminal y glandular. El objetivo es encontrar entre ellas potenciales biomarcadores que permitan el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas más rápidas y menos invasivas. Confrontado con la toma de la biopsia, la aspiración del líquido endometrial tiene la ventaja de ser una técnica mínimamente invasiva que no comporta riesgo para la paciente ni afecta a la tasa de implantación embrionaria. En esta dirección han sido enfocados estudios que trataban de caracterizar proteínas, lípidos y desde la pasada década ha ganado importancia el estudio de miRNAs. Los miRNAs son pequeños RNAs que no codifican para proteínas y que son potenciales reguladores epigenéticos de la función y de la expresión de miles de genes. Se unen a la extremidad 3’ del RNA mensajero diana y dependiendo del grado de complementariedad pueden, o bien mediar la inhibición de la traducción, o degradar el mRNA. En el endometrio los miRNAs están expresados de forma célula-específica y están regulados por esteroides, hecho que se denota por los cambios de expresión desde la fase pre-receptiva hasta la fase receptiva. Un estudio previo de nuestro laboratorio ha detectado 20 miRNAs secretados en el líquido endometrial, diferencialmente expresados a lo largo del ciclo natural. Gracias a este estudio hemos caracterizado el miRNA hsa-miR-30d-5p, cuyos niveles de expresión eran los más elevados, comparado con los otros, en la ventana de implantación, y hemos conseguido ver como el miRNA, libre o embebido en vesículas, se internaliza en las células del trofectodermo. Además, en un modelo in vitro con embriones de ratón tuvimos la evidencia de que los embriones tratados con este miRNA, tenían una mayor tasa de adhesión. Esto nos llevó a pensar que los miRNAs secretados en el líquido endometrial tenían una función de relevancia en la comunicación con el embrión y en el proceso de receptividad endometrial. Este estudio fue la base de esta tesis doctoral que está dirigida a la determinación de los perfiles de los miRNAs a lo largo de la fase lútea de mujeres en ciclo natural y sucesivamente tratadas con los métodos que se utilizan en las prácticas de reproducción asistida para la estimulación ovárica controlada (COS, del inglés Controlled ovarian stimulation) y terapia de reemplazo hormonal (HRT, del inglés Hormone replacement therapy). Este trabajo de tesis doctoral está enfocado en la caracterización y en la búsqueda de miRNAs como posibles biomarcadores en el líquido endometrial que pudieran, en un futuro, servir para el desarrollo de una nueva herramienta de diagnóstico no invasiva para predecir el momento de receptividad endometrial. HIPÓTESIS La aspiración del líquido endometrial es considerada una técnica mínimamente invasiva. Esta propiedad le confiere la característica de ser un método ideal para el diagnóstico de la receptividad endometrial. Previamente, hemos demostrado que el endometrio secreta miRNAs en el líquido endometrial durante la ventana de implantación que son recibidos por el embrión y que potencialmente podrían regular el proceso de implantación. Nuestra hipótesis es demostrar la existencia de un perfil de expresión diferencial de miRNAs en el líquido endometrial que permitiría el reconocimiento de la ventana de implantación. OBJETIVOS Objetivos generales -Caracterizar el perfil de miRNAs en el líquido endometrial a lo largo de la fase lútea del ciclo natural, ciclo de terapia de reemplazo hormonal (HRT), ciclo de estimulación ovárica controlada (COS) con gonadotropina coriónica humana (hCG) (COS +hCG) y con agonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) (COS +GnRH-a). -Describir los miRNAs diferencialmente expresados en las mismas pacientes en ciclo natural y ciclo HRT. -Caracterizar las diferencias en la expresión de los miRNAs que existen entre COS +hCG y COS +GnRH-a en las mismas pacientes. Objetivos específicos -Comparar los perfiles de miRNAs en el líquido endometrial entre fase pre-receptiva y receptiva en cada tratamiento para identificar posibles biomarcadores de receptividad endometrial. -Validar los miRNAs diferencialmente expresados obtenidos gracias al análisis bioinformático. -Basándonos en los perfiles de los 238 genes de ERA, identificar in silico, las posibles dianas de los miRNAs. -Demonstrar in vitro la relación inversa entre miRNA/mRNA diana. MÉTODOS Recolección de muestras Se obtuvieron 125 muestras de líquido endometrial reclutadas en la clínica IVI Valencia a partir de 47 voluntarias donantes de óvulos según los criterios de inclusión establecidos para este estudio. El estudio ha sido aprobado por el Comité ético de investigación clínica (CEIC): 1304-C-117-FV. Las muestras han sido tomada a lo largo de la fase lútea en ciclos natural en día LH +0, LH +3, LH +5 y LH +7; En HRT, específicamente en día P +0, P +1, P +3, P +5 y P +7; en COS +HCG en día hCG +0, hCG +3, hCG +5, hCG +7 y hCG +9 y finalmente en COS +GnRH-a en día GnRH-a +0, GnRH-a +3, GnRH-a +5, GnRH-a +7 y GnRH-a +9. Una vez obtenidas, las muestras se guardaron congeladas a -80ºC hasta su procesamiento. Extracción de RNA total y secuenciación De cada muestra se obtuvo RNA total utilizando el kit comercial miRNeasy mini kit (Qiagen). Para identificar los miRNAs diferencialmente o exclusivamente expresados en la ventana de implantación de los cuatro ciclos hemos utilizado secuenciación masiva. Para la construcción de las librerías se ha utilizado TruSeq Small RNA Sample Pre Kit, Illumina. Las librerías cualificadas y amplificadas han sido secuenciadas en la plataforma Illumina HiSeq2000/1000. Análisis bioinformático El análisis bioinformático se ha llevado a cabo con el objetivo de determinar los miRNAs que se expresan de manera diferencial, entre fases correspondientes de diferentes ciclos y entre diferentes fases dentro del mismo ciclo. El análisis de expresión diferencial se llevó a cabo utilizando los paquetes de Biocondcutor edgeR_3.10.0 y DESeq2_1.8.1 EdgeR y DESeq2. Los miRNAs que no expresaban más de 1 lectura por millón (CPM) en al menos 3 muestras han sido excluidos del análisis. Sólo los miRNAs diferencialmente expresados en los dos métodos con un valor de “fold change” superior a 2 y con FDR (del inglés False discovery rate) <0.05 fueron considerados para los análisis. Validación datos de secuenciación Por cada comparativa entre fase pre-receptiva y receptiva de cada ciclo, se seleccionaron unos miRNAs para su validación mediante técnica de RT-qPCR. Análisis funcional El análisis funcional ha sido focalizado hacia los genes incluidos en el predictor del ERA. De esta forma, hemos utilizado los perfiles de los miRNAs diferencialmente expresados durante el ciclo sustituido y los hemos comparado con los perfiles transcriptómicos de las dianas, Solo aquellas interacciones que tenían tendencia opuesta fueron seleccionadas. Partiendo de nuestros previos resultados en que hemos demostrado la importancia de hsa-miR-30d-5p durante el proceso de la implantación embrionaria y su importante papel durante la comunicación materno-fetal, nos dirigimos a la validación de su interacción con KIF11 en un modelo in vitro con células Ishikawa, línea celular comúnmente usada como modelo de epitelio endometrial luminal. Las células han sido transfectadas con un análogo (mimic) de hsa-miR-30d-5p y con un inhibidor que inhibe la expresión del miRNA endógeno. RESULTADOS La caracterización de los miRNAs en el líquido endometrial procedente de los distintos días de la fase lútea en ciclo natural ha permitido caracterizar el perfil fisiológico de los miRNAs. De esta forma, hemos identificado 72 miRNAs diferencialmente expresados que son secretados en el líquido endometrial a lo largo de la fase lútea de mujeres que no han recibido ningún tratamiento hormonal. Profundizando en la búsqueda de potenciales biomarcadores de la receptividad endometrial, la comparativa entre la fase pre-receptiva tardía (LH +5) vs. receptiva (LH +7) no se ha encontrado ningún miRNA diferencialmente expresado. Sin embargo, 5 miRNAs se han encontrado diferencialmente expresados (reprimidos) entre LH +3 vs LH +7. Entre ellos se ha validado la expresión para hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-873-3p, y hsa-miR-141-3p. La sincronización endometrial con el estado de desarrollo embrionario puede llevarse a cabo en ciclo natural, monitorizando el momento de la ovulación o se puede llevar a través de HRT. Debido a que la fase lútea de las mujeres en ciclo natural no siempre es constante, el transfer en HRT representa la mejor opción. Por esta razón hemos caracterizado los perfiles de miRNAs secretados en el líquido endometrial de mujeres en HRT, en la cual, hemos encontrado 154 miRNAs diferencialmente expresados como resultado de todas las comparativas dentro del ciclo. Específicamente, en la comparativa entre P +3 vs. P +5 hemos obtenido 15 miRNAs diferencialmente expresados. Entre ellos se ha validado la expresión de hsa-miR-223-3p y hsa-miR-582-5p, dos miRNAs cuyos niveles están muy altos en la fase receptiva. Gracias a la comparativa de los perfiles de miRNAs secretados en las mismas fases de los dos ciclos hemos revelado que no hay diferencias significativas entre los perfiles de miRNAs secretados. El análisis funcional ha mostrado 62 interacciones validadas con los genes del ERA y 81 interacciones predichas que concuerdan con nuestros parámetros de selección. La interacción miR-30d-KIF11 se ha validado en nuestro modelo in vitro de epitelio luminal. Los resultados demuestran que los niveles de mRNA de KIF11 bajan de forma consistente después de 48h de transfectar con el mimic de hsa-miR-30d-5p. Consistentemente, los niveles de KIF11 no bajan, sino que ligeramente se incrementan en la condición en la que las células habían sido transfectadas con un inhibidor del hsa-miR-30d-5p. En las técnicas de reproducción asistida otro aspecto importante es la obtención de ovocitos que se lleva a cabo mediante los ciclos de estimulación ovárica controlada. En nuestro estudio hemos llevado a cabo la caracterización de la fase lútea de ciclos estimulados con hCG y con GnRH-a. En el ciclo COS +hCG se han encontrado un total de 351 miRNAs diferencialmente expresados, y representa el ciclo con el mayor número de miRNAs diferencialmente expresados. No obstante, las diferencias entre hCG +5 y hCG +7 se reducen a 3 miRNAs diferencialmente expresados (sobreexpresados). Estos son hsa-miR-410-3p, hsa-miR-431-3p y hsa-miR-127-5p y su mayor expresión ha sido validada en hCG +5. Con referencia al ciclo con GnRH-a, hemos caracterizado 322 miRNAs diferencialmente expresados. También en este caso encontramos 3 miRNAs entre GnRH-a +5 y GnRH-a +7. De estos hemos validado la expresión en dos miRNAs, hsa-miR-181a-3p y hsa-miR-224-5p. Los resultados de la comparativa entre las mismas fases de los ciclos estimulados que difieren en el desencadenante de la ovulación han mostrado que, en las comparativas entre fases pre-receptivas obteníamos muy pocas diferencias significativas. Interesantemente, el número de miRNAs diferencialmente secretados se incrementa significativamente en la comparativa entre las fases receptivas hCG +7 y GnRH-a +7. En esta comparativa encontramos 47 miRNAs diferencialmente expresados. Entre los miRNAs menos expresados en el ciclo con GnRH-a hemos validado la expresión de 4 miRNAs (hsa-miR-4772-5p, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR184 y hsa-miR146b-5p). CONCLUSIONES 1. La aspiración del líquido endometrial representa una técnica mínimamente invasiva para el estudio de miRNAs durante la fase lútea del ciclo menstrual y para el desarrollo de herramientas de diagnóstico para evaluar la función endometrial. 2. Considerando los diferentes miRNAs diferencialmente expresados durante el ciclo natural, los ciclos de estimulación ovárica y el ciclo sustituido, podemos confirmar que los tratamientos hormonales influyen en la secreción de los miRNAs al líquido endometrial. 3. En cada tratamiento hemos sido capaces de encontrar potenciales miRNAs biomarcadores de receptividad endometrial. En LH +3 vs. LH +7 (hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-873-3p, y hsa-miR-141-3p), en P +3 vs. P +5 (hsa-miR-223-3p y hsa-miR-582), en COS +hCG en hCG +5 vs. hCG +7 (hsa-miR-410-3p, hsa-miR-431-3p y hsa-miR-127-5p) y finalmente en COS +GnRH-a en GnRH-a +5 vs. GnRH-a +7 (hsa-miR-181a-3p y hsa-miR-224-5p). 4. No se han encontrado diferencias significativas en la expresión de los miRNAs entre ciclo natural y ciclo sustituido. Esta conclusión apoya la similitud del estado del endometrio en los dos ciclos. 5. Hemos identificado, con los genes del ERA, 62 interacciones validadas y 81 interacciones predichas de los miRNAs diferencialmente expresado en ciclo de HRT. 6. Basado en el perfil de expresión de los miRNAs en los cuatro ciclos podemos concluir que el endometrio alcanza la receptividad de manera diferente en ciclo natural/HRT comparado con los ciclos estimulados. 7. Las diferencias encontradas en la comparativa entre la fase receptiva de ambos ciclos estimulados, y sobre todo, la evidencia de que miRNAs como el hsa-miR-30d-5p, considerado fundamental en la ventana de implantación, esté menos secretado en COS +GnRH-a sugiere una investigación adicional para entender el efecto de la GnRH-a en el endometrio.