Carbamato quinasa de pyrococcus furiosusrelaciones estructura-funcion y papel en la biosintesis de carbamilfosfato

Resumen

En la presente tesis se han llevado a cabo estudios de estructura-función de la carbamato quinasa (CK) de la arquea hipertermófíla pyrococcus furiosus, relacionados con la estabilidad de la enzima y con la caracterización funcional del sitio catalítico. Además, se ha propuesto un nuevo papel fisiológico para la carbamato quinasa de organismos hipertermófilos. Carbamato quinasa pertenece a la familia de enzimas aminoácido quinasa (PFO0696) y cataliza la transferencia reversible de un grupo y-fosforilo del A TP a un grupo carbamato, resultando en la síntesis de un anhídrido de acilfosfato. La función establecida de CK es generar A TP a partir de CP, obtenido por la ruta de la arginina deiminasa. Aunque hemos demostrado que en el hábitat natural de las arqueas hipertermófilas pyrococcus furiosus, CK puede sintetizar CP para la biosíntesis de pirimidinas y arginina y por tanto, reemplazar in vivo la función anabólica clásicamente reservada a CPS. Se conoce la estructura tridimensional de dos CKs: una mesófila de Enterococcus faecalis, y otra hipertermófila de Pyrococcus furiosus. Estas presentan una identidad de secuencia próxima al 50% y estructuras tridimensionales prácticamente superponibles. Aunque el análisis comparativo de la estructura primaria y tridimensional de ambas CKs muestra como principales factores implicados en la estabilidad de la enzima hipertermófila: 1) la presencia de un mayor número de residuos cargados, pares iónicos y redes de pares iónicos en superficie, y 2) la existencia de una superficie de dimerización mucho mayor y más hidrofóbica en la enzima de pirococo. El estudio mediante mutagénesis de una red de pares iónicos presente en la superficie de la enzima, que por su extensión y localización, podría contribuir en la estabilidad, formada por los residuos Lys307, Glu305, Arg43, Glu39 y Arg104, muestra que la relación entre flexibilidad y actividad, y la estabilidad térmica de la proteína no se afectan drásticamente, aunque, revela que la extensión y naturaleza de la red influye en la estabilidad. El conocimiento de la estructura tridimensional de la CK de P. furiosus y de la NAGK de E. coli (paradigma estructural de la familia MK) permitió elaborar una serie de predicciones estructurales sobre la unión de nucleótido y sobre el mecanismo catalítico para ambas enzimas que podrían ser extrapolables al resto de miembros de la familia de enzimas aminoácido quinasa (MK). Se ha estudiado en la CK de P. furiosus, mediante mutagénesis dirigida, diferentes funcionalmente las predicciones, demostramos la importancia para la estabilización y afinidad del nucleótido de las interacciones mediadas por los residuos tirosina 244 y metionina 274 con la base piridimidínica, e identificamos los residuos catalíticos Lys131, Lys215 y Asp216. Nuestros resultados apoyan la concepción actual del mecanismo de transferencia de fosforilo en la familia MK y aportan información sobre los cambios conformacionales asociados a la unión de ligandos e ilumina sobre las grandes diferencias exhibidas en afinidad para el nucleótido entre la CK de pirococo y el resto de enzimas de la familia AAK.