Estudio de la función de los factores de transcripción pbx en la diferenciación a neurona dopaminérgica del bulbo olfatorio de ratón

Resumen

Las neuronas dopaminérgicas regulan una amplia variedad de comportamientos; defectos en la función o supervivencia de estas neuronas dan lugar a patologías tan importantes como el Parkinson. Todas las neuronas dopaminérgicas se caracterizan por la expresión de una batería de genes que codifican para un grupo de proteínas implicadas en la síntesis, transporte y recaptación de la dopamina. Por tanto, conocer los factores de transcripción que activan a estos genes es el primer paso para descubrir las claves de la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas. Los genes de la vía de la síntesis de la dopamina están altamente conservados a lo largo de la evolución. Estudios en el nematodo C.elegans han demostrado que tres factores de transcripción, CEH-20 (factor de la familia PBX), AST-1( factor de la familia ETS) y CEH-43 (factor de la familia Homeodominio) son necesarios para la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas (DA). Estos factores actúan de forma coordinada uniéndose a las regiones reguladoras y activando la expresión del transcriptoma dopaminérgico, incluyendo los genes que codifican para las enzimas de biosíntesis de la dopamina. El sistema dopaminérgico en mamíferos se distribuye en núcleos del mesencéfalo, diencéfalo y bulbo olfatorio. Sin embargo, en este proyecto nos hemos centrado en el estudio de las neuronas dopaminérgicas del bulbo por una parte por ser la población más ancestral en evolución y por otra porque expresan los ortólogos para AST-1 y CEH-43 (ER81 y DLX2 respectivamente) que, de manera homologa a C.elegans, también participan en la correcta diferenciación dopaminérgica. Nuestro principal interés por tanto, ha sido estudiar si homólogos de CEH-20, el tercer factor conocido en el gusano, participan de manera directa en la especificación dopaminérgica del bulbo en organismos superiores como el ratón. En mamíferos, existen cuatro miembros en la familia PBX: Pbx1, Pbx2, Pbx3 y Pbx4. El estudio de su expresión en el bulbo, mediante inmunotinción doble con tyrosina hidroxilasa (marcador DA) y los factores PBX, determinó que tanto Pbx1 (Isoforma 1a pero no 1b) como Pbx2 se expresan en las neuronas DA del bulbo olfatorio de neonatos y adultos. El mismo estudio también reveló que, la expresión de PBX1a y PBX2 no es exclusiva de las neuronas dopaminérgicas sino que también se expresan en otras células de la capa periglomerular así como en la capa granular (capa más interna) del bulbo olfatorio. Análisis de expresión de la tyrosina hidroxilasa en mutantes condicionales para Pbx1 específicos del linaje dopaminérgico, mutantes nulos para Pbx2 y dobles mutantes demuestran que Pbx1 pero no Pbx2 es necesario para la diferenciación a neurona dopaminérgica embrionaria y postnatal del bulbo olfatorio. Estudios posteriores de linaje celular, en el que las neuronas del linaje dopaminérgico quedan permanentemente marcadas con la proteína verde fluorescente demuestran que en los mutantes para Pbx1 las neuronas están presentes pero no llevan a cabo su correcta diferenciación. Por otra parte, también se observó que un pequeño porcentaje de las neuronas del linaje DA en mutantes para Pbx1 expresa ectópicamente CR y/o CB sugiriendo un cambio de destino celular de DA a CR y/o CB. No obstante, no se apreciaron diferencias significativas en el número de células CR y CB positivas entre controles y mutantes debido a que representan un porcentaje muy pequeño de la población total de CR y de CB. Además, los experimentos indicaron que Pbx1 regula la expresión de otros factores de transcripción necesarios para la diferenciación dopaminérgica como MEIS2 y COUP-TF1. Asimismo, los experimentos de electroporación in vivo en ratones neonatos confirman que el fenotipo observado en el bulbo olfatorio no es un efecto secundario derivado de posibles defectos en la población dopaminérgica del mesencéfalo y que puede ser rescatado por la isoforma Pbx1a pero no por Pbx1b. Finalmente, demostramos que la sobreexpresión de PBX1a y PBX1b incrementa la diferenciación a neurona dopaminérgica en las células electroporadas. De esta forma proponemos a PBX1a como homologo funcional de CEH-20 reforzando así la hipótesis de una posible conservación evolutiva en la diferenciación a neurona dopaminérgica entre gusano y ratón.