Modelo quirúrgico experimental para transferencia génica hepática en un órgano aislado in vivo

Resumen

Para realizar una terapia génica eficaz, múltiples estudios sugieren crear un ambiente adecuado con el objetivo de que el gen pueda entrar y permanecer en la célula para poder realizar su función. En este estudio se describe una estrategia quirúrgica para el aislamiento in vivo del hígado de cerdo, consiguiendo un órgano vascular hermético que permite, después de evaluar las condiciones de inyección génica, la creación de un modelo quirúrgico óptimo para la transferencia génica, utilizando un gen con interés terapéutico y midiendo la entrega del gen, la transcripción, la traducción y por último la proteína en sangre. Se utilizaron 24 cerdos hembra, el estudio se realizó en 3 fases, en la primera fase (n=2) se diseñó el modelo quirúrgico, evaluando la viabilidad del mismo. Se establecieron las condiciones de la administración del gen al tejido hepático, el volumen y las velocidades de perfusión. Se definieron las dos vías para la administración del gen (vía anterógrada o vena porta y vía retrógrada o vena cava). En la segunda fase (n=14), se procedió a evaluar las dos vías de administración con las distintas condiciones establecidas con el fin de valorar el modelo quirúrgico óptimo para la realización del procedimiento. En la tercera fase (n=8), una vez establecida la vía de administración, las condiciones ideales de volumen y velocidad de perfusión, se procedió a utilizar un gen con interés terapéutico, midiendo los valores de éste en sangre diez días después de realizado el procedimiento quirúrgico. En cuanto a la técnica quirúrgica, se crearon tres modelos que se distinguen por la vía de administración, volumen y velocidad de perfusión del gen. En estos tres modelos se realizó laparotomía media supra-infra umbilical identificando y disecando la arteria hepática, la vena porta, la vena cava suprahepática y la vena cava infrahepática, preparándolas para realizar la exclusión vascular total. A continuación, la vascularización hepática se excluyó durante 5-7 minutos. Estos procedimientos fueron comunes en todos los modelos creados. En la primera fase del estudio, se creó el modelo quirúrgico 1, en el cual se administró el gen eGFP (que codifica la proteína fluorescente verde) por vena cava y vena porta simultáneamente a una velocidad de 40 y 60 ml/s con un volumen de 400 y 600 ml respectivamente. En la segunda fase del estudio se creó el modelo quirúrgico 2, en el cual se administró el gen eGFP por vena cava con velocidades de 10 y 20 ml/s con un volumen de 200 ml y también el modelo quirúrgico 3, en el cual se administró el gen eGFP por la vena porta con velocidades de 10 y 20 ml y volumen de 200 ml. En la tercera fase del estudio se utilizó el modelo quirúrgico 2 para evaluar la transferencia génica utilizando la interleuquina 10 como gen de interés terapéutico. Las constantes vitales del animal se monitorizaron durante la cirugía para evaluar la seguridad del procedimiento. Se observaron niveles plasmáticos de enzimas hepáticas después de las 24 horas del procedimiento. Los resultados confirmaron la eficacia del procedimiento. El modelo quirúrgico 2, reveló que es más efectivo que los otros modelos en el momento de la transcripción del gen al tejido hepático y es por ello que se utilizó en la tercera fase del procedimiento empleando el gen hIL-10. La medición de la proteína IL-10 en sangre al décimo día post-procedimiento resultó significativo confirmando nuevamente la efectividad del modelo quirúrgico 2. El procedimiento no es perjudicial para los animales y ofrece una amplia gama de opciones de administración génica porque permite diferentes formas de perfusión (anterógrada y retrógrada) y diferentes caudales para determinar las condiciones óptimas de transferencia de genes. La perfusión del gen por vena cava (vía retrograda) a una velocidad de 20 ml/s y con un volumen de 200 ml es el procedimiento ideal para realizar una terapia génica eficaz. Esta estrategia abre el camino para el uso de terapia celular y terapia génica hepática viral o no viral, especialmente indicada en una amplia variedad de enfermedades heredadas o adquiridas debido a la capacidad del hígado de producir y suministrar proteínas al torrente sanguíneo.