Analysis of structural plasticity in the adult and adolescent mouse brain. Effects of erythropoietin

Resumen

INTRODUCCIÓN Los organismos están sujetos diariamente a cambios que ocurren en su entorno y dentro del propio organismo. Estas entradas de información del medio externo e interno son integradas y analizadas por el organismo con el fin de dar una respuesta adecuada que asegure la supervivencia. Es crucial, por lo tanto, que el sistema responda de forma apropiada al amplio abanico de cambios y demandas que acontecen a lo largo de la vida del organismo. En este aspecto, el sistema nervioso se destaca como uno de los principales sistemas encargados de mantener el orden interno y reaccionar con cambios adaptativos a los eventos que lo rodean. Un funcionamiento aberrante del sistema da lugar a las diferentes enfermedades neuropsiquiátricas que se conocen actualmente. Aunque la mayoría de los organismos poseen un sistema nervioso, la complejidad varía enormemente ofreciéndonos una excelente visión de la evolución de este sistema. En el caso de los vertebrados, ha evolucionado de tal forma que lo convierte en uno de los sistemas más sofisticados que gobiernan la vida animal. En este aspecto, el sistema nervioso se puede dividir en dos regiones principales: el sistema nervioso central (SNC), que está formado por el cerebro y la médula espinal, y el sistema nervioso periférico (SNP), compuesto por todos los nervios aferentes y eferentes que conectan cada parte del cuerpo con el SNC. Aunque el sistema nervioso está formado por un conjunto muy diverso de células, podemos destacar dos grupos principales: las neuronas y las células gliales. Las neuronas son consideradas la unidad funcional principal del sistema nervioso y fueron profundamente estudiadas por Ramón y Cajal (Ramón y Cajal, 1909), asentando las primeras bases funcionales de este complejo sistema. A pesar de ser considerado como un sistema estático durante las últimas décadas, hoy en día se sabe que ciertas regiones conservan una marcada capacidad de remodelación, no solo durante el desarrollo sino también durante la edad adulta, aunque en menor proporción (Xerri, 2008). Dicha plasticidad está presente en condiciones normales y permite al sistema lidiar con nuevas experiencias, aprender y reaccionar adaptativamente a diferentes factores intrínsecos o extrínsecos. Dentro de estos procesos plásticos se encuentran las alteraciones en la estructura de las neuronas, conocido como plasticidad estructural, la cual puede ser modulada a través de cambios en la neurotransmisión, estructuras relacionadas con la plasticidad, o el efecto de diferentes factores tróficos y hormonas. La presente tesis se centrará en la plasticidad estructural de las neuronas y su modulación a través de diferentes paradigmas, en dos de las regiones cerebrales que mantienen una marcada plasticidad incluso en cerebro adulto: la corteza prefrontal (CPF) y el hipocampo. Descripción de las áreas de estudio La CPF es una corteza asociativa ubicada en la parte anterior del lóbulo frontal del cerebro de los mamíferos (Fuster, 2015). Esta región del cerebro está implicada en la planificación del comportamiento cognitivo complejo, la memoria de trabajo, la toma de decisiones y la moderación del comportamiento social, entre otros (Carlson et al., 2006). Un mal funcionamiento de esta corteza conduce a una serie de afecciones patológicas involucradas en trastornos neuropsiquiátricos como la esquizofrenia, depresión severa o demencia (Bicks et al., 2015; Kolb and Gibb, 2015). Por otra parte, el hipocampo es una de las regiones más antiguas, altamente conservada en las diferentes especies (Allen and Fortin, 2013). Destaca por el papel clave que desempeña en la memoria a corto y largo plazo, pero también por su función en la navegación espacial, el comportamiento emocional y la regulación de las funciones hipotalámicas. Alteraciones que afectan la integridad de esta región están asociadas con diversos desórdenes como el Alzheimer, depresión, o esquizofrenia (Anand and Dhikav, 2012). Tipos neuronales estudiados En general, las neuronas pueden clasificarse atendiendo a sus características estructurales, sus propiedades electrofisiológicas y sus propiedades neuroquímicas. De esta clasificación surgen dos tipos principales de neuronas: las neuronas excitadoras (entre las que destacan las neuronas piramidales por su gran proporción) y las neuronas inhibidoras, generalmente denominadas interneuronas. Ambas poblaciones están presentes en el CPF y el hipocampo (aunque con ciertas semejanzas y diferencias), y serán el objeto de estudio de la presente tesis. Las neuronas piramidales excitadoras son más numerosas y presentan una menor diversidad en comparación con las interneuronas (Thomson, 2007). Se trata de neuronas glutamatérgicas y, por lo tanto, liberan glutamato para su comunicación, el principal neurotransmisor excitador en el cerebro (Spruston, 2008; Van Aerde y Feldmeyer, 2015). Presentan una morfología caracterizada por un cuerpo celular de forma piramidal (soma), un solo axón y dos árboles dendríticos distintos, basal y apical (Spruston, 2008). Destaca la presencia de espinas dendríticas tanto en sus dendritas apicales como basales (Hotulainen and Hoogenraad, 2010; Rochefort and Konnerth, 2012). Las espinas dendríticas son pequeñas protuberancias que constituyen el elemento postsináptico en una sinapsis. Su función principal es proveer de un compartimento local para las vías de señalización y restringir la difusión de moléculas postsinápticas (Rochefort y Konnerth, 2012). En el elemento presináptico, el axón también muestra engrosamientos membranosos llamados botones axónicos que contienen y liberan las vesículas sinápticas que albergan los neurotransmisores (Kevenaar y Hoogenraad, 2015; Spruston, 2008). Ambas estructuras constituyen los elementos post y presinápticos de una sinapsis que regulan la llegada y salida, respectivamente, de las señales de comunicación con otras neuronas. Las interneuronas se caracterizan, generalmente, por la presencia de un axón corto de proyección local. Como neuronas inhibidoras, se consideran interneuronas GABAérgicas que utilizan el ácido gamma-aminobutírico (GABA) como neurotransmisor primario. Son menos numerosas, pero comprenden una amplia población (Booker y Vida, 2018; Defelipe et al., 2013). Sus diferentes dianas postsinápticas, las diferencias en el dominio subcelular, la conectividad y las propiedades intrínsecas de membrana hacen de ellas un grupo heterogéneo cuya clasificación ha sido objeto de debate hasta la fecha. En la presente tesis doctoral, se ha usado la clasificación molecular de la terminología de Petilla (Ascoli et al, 2008) la cual establece cinco tipos de interneuronas dependiendo de la expresión de diferentes proteínas quelantes de Ca2+ y neuropéptidos, como son: parvalbúmina, somatostatina, neuropéptido Y, péptido intestinal vasoactivo y colecistoquinina. Para los estudios de esta tesis, han sido de principal interés las interneuronas que expresan parvalbúmina, somatostatina y colecistoquinina. Las interneuronas que expresan parvalbúmina pueden clasificarse en dos grupos, células en cesto y células en candelabro, presentes tanto en el CPF como hipocampo (Tremblay et al., 2016; Booker y Vida, 2018). Las células en candelabro hacen sinapsis exclusivamente sobre el segmento inicial del axón de las neuronas piramidales, mientras que las células en cesto deben su nombre a las cestas perisomáticas que establecen alrededor del soma y dendritas proximales de las neuronas piramidales (Defelipe et al., 2013). En esta tesis, los estudios se han centrado principalmente en este último tipo, uno de los más estudiados por sus propiedades. Las células en cesto funcionan como mecanismos de relojería controlando el disparo y precisión de las células piramidales, probablemente a través del alto número de sinapsis que cada célula en cesto puede establecer con varias neuronas piramidales. El segundo gran tipo lo componen las interneuronas que expresan el neuropéptido somatostatina. Están presentes en toda la corteza cerebral, incluidos el CPF (Tremblay et al., 2016) y el hipocampo (Somogyi y Klausberger, 2005). En esta tesis, se han estudiado especialmente dos subpoblaciones de interneuronas que expresan somatostatina: las células de Martinotti en el CPF y las células O-LM en el hipocampo. Este tipo de interneuronas presenta una amplia gama de morfologías, pero su función principal es inhibir la parte distal del árbol dendrítico de las neuronas piramidales con el cual establecen contacto, generalmente en una comunicación recíproca (Scheyltjens y Arckens, 2016; Urban-Ciecko y Barth, 2016). Entre las interneuronas, son especialmente importantes debido a la presencia de espinas dendríticas a lo largo de sus dendritas que pueden sufrir remodelado dendrítico en respuesta a diferentes eventos. En último lugar, en esta tesis también han sido objeto de estudio las interneuronas que expresan el neuropéptido colecistoquinina, presentes tanto en el CPF (Tremblay et al., 2016) como el hipocampo (Booker y Vida, 2018). Del mismo modo que las células en cesto que expresan parvalbúmina, estas interneuronas también inervan la región perisomática y las dendritas proximales de las neuronas piramidales. Una característica relevante y que nos ha facilitado su estudio, es la expresión del receptor de cannabinoides 1 (CB1r) en sus terminales axónicos. Tanto las neuronas piramidales como las interneuronas, están sujetas a procesos de plasticidad estructural que pueden ser modulados, entre otros, por cambios en la neurotransmisión, la expresión de estructuras relacionadas con la plasticidad y diferentes factores tróficos y hormonas. Estos cambios estructurales pueden estudiarse a diferentes niveles, desde cambios en la longitud y complejidad de los árboles dendríticos, alteraciones en la densidad y morfología de sus espinas dendríticas hasta cambios en la densidad de los botones axónicos. Efectos de la neurotransmisión excitadora e inhibidora sobre la plasticidad Una alteración de los sistemas glutamatérgico y GABAérgico que perturbe el balance de excitación/inhibición, puede afectar a la integridad de las neuronas, produciendo desde cambios en la expresión de moléculas hasta fenómenos de remodelación neuronal. Respecto al sistema glutamatérgico, utiliza glutamato como principal neurotransmisor excitador, siendo las neuronas piramidales los miembros más numerosos de neuronas excitadoras. Para su estudio, son de gran ayuda ciertas proteínas de vesícula sináptica como el transportador vesicular de glutamato (VGLUT), un excelente marcador de terminales presinápticos excitadores. Se destaca también el estudio de la expresión de sinaptofisina (SYN), una de las proteínas de vesícula sináptica más abundante y conservada, alrededor del 10% de la proteína total de la vesícula (Takamori et al., 2006). Dicha proteína desempeña un papel clave en la formación de sinapsis dependiente de actividad (Tarsa y Goda, 2002), por lo que, junto con su presencia exclusiva en la vesícula sináptica, su expresión es usada ampliamente como marcador presináptico de ambos terminales, glutamatérgicos y GABAérgicos. El glutamato puede ejercer su función a través de receptores ionotrópicos y metabotrópicos. Entre los receptores ionotrópicos, se destacan tres tipos: los receptores del ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), N-metil-D-aspartato (NMDA) y kainato, presentes tanto en las neuronas piramidales como en las interneuronas (Akgül y McBain, 2016). Aunque su efecto final es semejante, la despolarización de la membrana postsináptica, su modo de acción y propiedades son ligeramente diferentes. La manipulación de estos receptores tiene efectos sobre ciertos procesos de plasticidad funcional y estructural como los que ocurren durante la memoria y el aprendizaje (Newcomer et al., 2000). Además, el uso de agonistas y antagonistas ha demostrado su implicación en la remodelación estructural de neuronas piramidales e interneuronas (McKinney, 2010; Perez-Rando et al., 2017; Pérez-Rando et al., 2017; Tian et al., 2007). El sistema GABAérgico, utiliza el GABA como neurotransmisor principal, sintetizado y utilizado por las interneuronas para su comunicación. Para su estudio, es de gran ayuda la expresión de ciertas moléculas. Es el caso del ácido glutámico decarboxilasa (GAD) que cataliza la síntesis de GABA a partir de glutamato, o del transportador vesicular de GABA (VGAT). Ambos son excelentes marcadores de terminales presinápticos GABAérgicos. El neurotransmisor GABA puede ejercer su función, hiperpolarización de la membrana postsináptica, a través de receptores ionotrópicos y metabotrópicos localizados tanto en neuronas piramidales como interneuronas (Pettit and Augustine, 2000). Entre los receptores ionotrópicos, destaca el papel del receptor GABAA. Este receptor ha sido de gran interés como diana de diferentes fármacos como es el caso de la benzodiacepina diazepam, un agonista alostérico de los receptores GABAA con propiedades ansiolíticas, sedativas, anticonvulsivas y miorelajantes. Las benzodiacepinas pueden actuar modulando la plasticidad sináptica. En el hipocampo, el uso del agonista diazepam aumenta la estabilización sináptica y la agrupación de receptores GABAA durante la actividad neuronal reduciendo así su difusión lateral, lo que resulta en una potenciación de las sinapsis inhibidoras (Gouzer et al., 2014; Lévi et al., 2015). La activación o inhibición de los receptores GABAA parece tener un papel adaptativo en las sinapsis GABAérgicas. Esta actividad es responsable de los rápidos efectos ansiolíticos, anticonvulsivos e hipnóticos de las benzodiacepinas. Sin embargo, su uso a largo plazo conduce al desarrollo de tolerancia como consecuencia de la eliminación gradual de los receptores de GABAA de la membrana postsináptica. Esta eliminación parece estar mediada por la activación de varias cascadas que finalmente causan su internalización y la interrupción de las sinapsis GABAérgicas inhibidoras (Nicholson et al., 2018). Alteraciones indirectas del nivel de neurotransmisión inhibidora a través del uso de diferentes hormonas como el estradiol y estrógenos, se han visto acompañadas de cambios en la estructura de las neuronas (Murphy et al., 1998; Tan et al., 2012). Estructuras relacionadas con la plasticidad estructural Existen dos estructuras relacionadas con fenómenos de plasticidad estructural de especial interés en la presente tesis: la forma polisializada de la molécula de adhesión celular neural (poliSia-NCAM) y las redes perineuronales (PNNs). PoliSia-NCAM se caracteriza por sus propiedades antiadhesivas y está implicada en eventos clave durante el desarrollo embrionario donde su expresión es máxima. Durante este periodo, facilita la correcta migración y diferenciación neuronal, el crecimiento de neuritas, así como el remodelado dendrítico y sináptico (Bonfanti, 2006; Gascon et al., 2007; Rutishauser, 2008). Aunque hay un notable descenso durante la edad adulta, su expresión puede encontrarse asociada a neuronas inmaduras de la corteza piriforme y nichos neurogénicos. Además, y de ahí el interés para la presente tesis, en el cerebro adulto se encuentra asociada a una subpoblación de interneuronas corticales maduras y elementos inhibidores de la CPF y el hipocampo (Gómez-Climent et al., 2011; Nacher et al., 2013), asociada principalmente a fenómenos plásticos. La adición de poliSia a NCAM está catalizada por dos polisialiltransferasas independientes, ST8SIA2 y ST8SIA4, con diferente patrón de expresión temporal y espacial (Hildebrandt et al., 2007). ST8SIA2 parece ser la principal enzima responsable durante el desarrollo embrionario, mientras que ST8SIA4 lo es en el cerebro adulto. Además, ST8SIA4 está principalmente implicada en la expresión de poliSia asociada a las interneuronas corticales maduras, mientras que ST8SIA2 es la principal enzima de las neuronas inmaduras de la corteza piriforme y nichos neurogénicos adultos (Nacher et al., 2010). Su íntima relación con las interneuronas hace que alteraciones en su expresión provocadas por diferentes paradigmas puedan afectar la estructura y conectividad de algunas subpoblaciones, y de manera indirecta también la de neuronas piramidales (Carceller et al., 2018; Castillo-Gómez et al., 2015, 2016b, 2017; Guirado et al., 2014b; Guirado et al., 2009). Además, la depleción de poliSia utilizando la enzima Endo-Neuraminidase-N (Endo-N) afecta la plasticidad estructural y la conectividad de interneuronas y neuronas piramidales (Castillo-Gómez et al., 2016a; Castillo-Gómez et al., 2016b; Guirado et al., 2014). Por otro lado, las PNNs son estructuras especializadas de la matriz extracelular que se encuentran alrededor del soma y dendritas de ciertos tipos neuronales restringiendo su conectividad y plasticidad (Wang and Fawcett, 2012). Las PNNs están constituidas por diversos componentes sintetizados no solo a partir de las propias neuronas, sino también de las células gliales circundantes, como los oligodendrocitos y astrocitos (Carulli et al., 2006). Todos ellos secretan las moléculas al espacio extracelular, donde se asocian con receptores de la superficie celular para conformar agregados heterogéneos. Entre sus principales componentes destaca al ácido hialurónico, proteoglicanos condroitín sulfato, tenascinas y proteínas de unión. Su aparición supone el cierre del periodo crítico de elevada plasticidad (Pizzorusso et al., 2002) y coincide con la maduración de las interneuronas y el establecimiento del adecuado equilibrio excitador/inhibidor (Harauzov et al., 2010; Morishita and Hensch, 2008). Por ello, las PNNs son ampliamente consideradas indicadores de maduración neuronal. Las PNNs se encuentran en varias regiones del cerebro, incluyendo el CPF y el hipocampo, principalmente alrededor de interneuronas GABAérgicas que expresan parvalbúmina (Celio, 1993; Kosaka y Heizmann, 1989). Algunos tratamientos son capaces de alterar la densidad de PNNs, lo cual se ha visto acompañado de cambios en la estructura de las neuronas (Castillo-Gómez et al., 2017; Guirado et al., 2014b). Dada su íntima relación con las interneuronas parvalbúmina, las PNNs juegan un papel clave en la actividad de estas interneuronas y, por lo tanto, en el equilibrio excitador/inhibidor. Moléculas que estimulan la plasticidad estructural en cerebro adulto Son varias las moléculas que pueden desempeñar un papel en la modulación de la plasticidad estructural de las neuronas, como son los factores tróficos y diversas hormonas. En cuanto a los factores tróficos, se trata de moléculas que promueven el crecimiento y supervivencia de un grupo específico de células. Entre ellos se encuentra el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF por sus siglas en inglés). Son diferentes los tratamientos que han demostrado su efecto sobre el remodelado neurítico (Amaral y Pozzo-Miller, 2007; Chapleau et al., 2009; Gonzalez et al., 2016). Por otro lado, algunas hormonas como la insulina o los glucocorticoides tienen un papel en diferentes aspectos de la plasticidad neural, lo cual se ha visto reflejado por sus efectos sobre la neurogénesis adulta y la plasticidad estructural y sináptica (Lee et al., 2011; Lucassen et al., 2014; M.F. et al., 2002). En esta tesis, se estudiará en profundidad la molécula de eritropoyetina (EPO), una hormona conocida principalmente por su papel como factor estimulador de la eritropoyesis, pero con propiedades interesantes en diferentes procesos cerebrales. Se ha visto que tanto la EPO como su receptor, EPOR, son expresados en el cerebro por neuronas y células gliales. Aunque ciertamente hay un notable descenso tras el desarrollo embrionario, aún mantienen una marcada expresión en ciertas áreas cerebrales incluyendo la CPF y el hipocampo Digicaylioglu et al., 1995; Ehrenreich et al., 2003; Ott et al., 2015). Su acción a través de su receptor EPOR promueve un amplio rango de acciones que incluyen efectos antiapoptóticos, antioxidantes y antiinflamatorios, tanto en neuronas como en células gliales. Además, promueve la supervivencia y proliferación celular, así como la neurogénesis adulta (Alnaeeli et al., 2012; Sirén et al., 2009). Durante los últimos años se ha demostrado su fuerte efecto procognitivo, no solo en pacientes y animales sanos sino también en cerebros comprometidos (Gao et al., 2015; El-Kordi et al., 2009; Adamcio et al., 2008; Ehrenreich et al., 2007a, 2007b; Miskowiak et al., 2007). Aunque tenemos alguna pista sobre las bases neurobiológicas que operan estos procesos cognitivos, poco se sabe sobre sus efectos sobre la plasticidad de las neuronas. OBJETIVOS El principal objetivo de esta tesis doctoral es estudiar el efecto que pueden tener diversas manipulaciones farmacológicas y genéticas sobre la plasticidad estructural de las neuronas excitadoras e inhibidoras del encéfalo de ratón, tanto en edad adulta como adolescente. Para alcanzar este objetivo principal, a continuación se detallan los diferentes objetivos planteados: 1. Evaluar el impacto que puede tener un aumento directo de la neurotransmisión inhibidora a través de un tratamiento crónico con la benzodiacepina diazepam, sobre la estructura de las neuronas piramidales de la corteza prefrontal. 2. Estudiar el efecto que puede tener una depleción genética de las polisialiltransferasas ST8SIA2 y ST8SIA4 sobre la estructura dendrítica y la conectividad de las interneuronas de la corteza prefrontal. 3. Estudiar el impacto de un tratamiento crónico con eritropoyetina sobre la estructura y conectividad de las neuronas inhibidoras de la región CA1 del hipocampo, alteración del balance excitación/inhibición, así como de estructuras relacionadas con la plasticidad. METODOLOGÍA Y RESULTADOS ♣ Efecto de un tratamiento crónico con la benzodiacepina diazepam sobre la plasticidad estructural de las neuronas piramidales Con el objetivo de ver cómo un aumento de la neurotransmisión inhibidora per se puede afectar a la densidad de espinas dendríticas de las neuronas piramidales de la capa V y la densidad de botones axónicos de la corteza cingulada, ratones macho adultos de 3 meses de la cepa THY1-YFP se han sometido a un tratamiento crónico con diazepam durante 21 días con una dosis ansiolítica pero no sedativa (2mg/kg, ip). En esta cepa de ratones transgénicos, un subconjunto de neuronas piramidales expresa de forma constitutiva la proteína amarilla fluorescente (YFP por sus siglas en inglés) entre las que se encuentran las neuronas piramidales ubicadas en las capas V y VI de la CPF y una gran población de neuronas piramidales del hipocampo (FengRebecca, 2010; Porrero et al., 2010). El diazepam es un agonista alostérico de los receptores GABAA, por lo que su administración crónica provocará un aumento de la neurotransmisión inhibidora. Aunque el objetivo principal es estudiar los efectos del diazepam sobre la morfología de las neuronas piramidales, también se han evaluado los efectos ansiolíticos del tratamiento con dos test de comportamiento relacionados con la ansiedad al inicio y 24 horas después de la última inyección. En la presente tesis se muestra como un aumento de la neurotransmisión inhibidora a través del uso del agonista diazepam, disminuye la densidad de espinas dendríticas de las neuronas piramidales de la capa V de la corteza cingulada. Este estudio es la primera evidencia, hasta la fecha, de que un aumento en la inhibición per se actuando directamente sobre los receptores GABAA, puede modificar la estructura de las neuronas piramidales de la CPF. Estos resultados están de acuerdo con estudios previos que observan cambios indirectos en la neurotransmisión inhibidora acompañados de cambios en la estructura de las neuronas (Murphy et al., 1998b; Tan et al., 2012). Todo ello sugiere que cambios en la inhibición parecen ocurrir antes o simultáneamente a los cambios en las conexiones excitadoras. Este tratamiento, sin embargo, no provoca cambios en la densidad de botones axónicos de las capas I-II de la corteza cingulada. Un trabajo descriptivo de los ratones THY1-YFP indica que los axones de estas capas probablemente surjan de las neuronas principales de la región de la amígdala (Porrero et al., 2010). La amígdala se ha relacionado con algunos de los efectos ansiolíticos que las benzodiazepinas pueden producir en el cerebro. Pese a su interés, debido a la alta densidad de neuronas marcadas en la cepa THY1-YFP, ha sido imposible realizar un estudio en esta zona. Sin embargo, el inmunomarcaje con VGLUT2, el transportador vesicular de glutamato que prevalece en las regiones extracorticales, ha confirmado que la mayoría de los axones ubicados en la corteza cingulada entre las capas I-II son de origen extracortical. Los datos obtenidos de los test de comportamiento muestran como el tratamiento crónico con diazepam no induce alteraciones en el nivel de ansiedad. A pesar de usar una dosis con efectos ansiolíticos reconocidos, no ha sido suficiente para inducir diferencias significativas en el nivel de ansiedad después de la administración crónica. Otros trabajos también han fallado en encontrar diferencias a este nivel o incluso apuntan hacia un aumento en el nivel de ansiedad (Prut y Belzung, 2003). Además, la cepa de ratones utilizada en el estudio muestra un alto comportamiento exploratorio incluso en condiciones normales (Bouwknecht y Paylor, 2002; Kim et al., 2002). Otras pruebas más sensibles podrían detectar cambios en el nivel de ansiedad. ♣ Impacto de la depleción genética de ST8SIA2 y ST8SIA4 sobre la estructura dendrítica y la conectividad de las interneuronas de la corteza prefrontal Con el objetivo de estudiar la contribución de cada polisialiltransferasa sobre la neuritogénesis y sinaptogénesis de las interneuronas corticales, se han usado dos cepas de ratones knock-out para cada una de ellas (ST8SIA2 y ST8SIA4), así como animales control. Estos animales poseen además una subpoblación de interneuronas que expresan la proteína verde fluorescente bajo el promotor de GAD67 (GAD67-GFP por sus siglas en inglés), lo cual facilita su estudio morfológico. Concretamente, se ha analizado la estructura y la conectividad de las interneuronas de las cortezas prelímbica e infralímbica. Al alcanzar los 3 meses de edad, todos los animales han sido sacrificados y sus cerebros procesados para los diferentes estudios. Con el fin de conocer en qué subpoblación de interneuronas se realizan los análisis, se ha caracterizado el fenotipo neuroquímico de estas interneuronas GAD67-GFP de las cortezas prelímbica e infralímbica. Para ello, se han usado diferentes marcadores de interneuronas como parvalbúmina, calretinina y calbindina. Este estudio muestra como la mayor parte de las células GAD67-GFP coexpresan mayoritariamente los marcadores parvalbúmina y calbindina, y en menor proporción calretinina. Además, los porcentajes son similares en las tres cepas analizadas. Estos datos son consistentes con estudios previos realizados en la corteza motora de ratones GAD67-GFP (Tamamaki et al., 2003). En el presente estudio, se muestra además que solo la depleción genética de la enzima ST8SIA4, y no la de ST8SIA2, es capaz de producir una reducción significativa en la arborización dendrítica de las interneuronas GAD67-GFP prefrontocorticales comparado con los animales control. Este dato sugiere que la síntesis y la unión de poliSia producida por ST8SIA4 es necesaria para el correcto desarrollo del árbol dendrítico de estas interneuronas. Aunque no se ha podido diferenciar los diferentes subtipos de interneuronas para referir el análisis estructural a una subpoblación específica, no se han observado espinas dendríticas en las interneuronas GAD67-GFP analizadas, lo cual excluye a las células Martinotti del análisis dendrítico (Gilabert-Juan et al., 2013c). Por otra parte, el análisis de la densidad perisomática inhibidora sobre neuronas piramidales de las cortezas prelímbica e infralímbica, muestra una reducción en la densidad total de puncta que expresan parvalbúmina en ambas cepas knock-out para ST8SIA4 y ST8SIA2. Para llevarlo a cabo, se ha analizado la densidad de puncta que expresan parvalbúmina y sinaptofisina alrededor del soma de neuronas excitadoras marcadas por inmunohistoquímica. Además, la disminución en la densidad de puncta que coexpresan parlvalbúmina y sinaptofisina indica una reducción en el número de sinapsis activas. Estos datos contrastan con estudios previos donde se analiza el efecto de la depleción de poliSia usando la enzima Endo-N (Castillo-Gómez et al., 2011, 2016). Esto sugiere un papel diferencial de la expresión de poliSia durante el desarrollo temprano de la interneurona (como es el caso de nuestros ratones transgénicos) en comparación con su presencia durante la edad adulta (pudiendo ser alterada por depleción enzimática) cuando parece desempeñar un papel aislante (Castillo-Gómez et al., 2011; Nacher et al., 2013). ♣ Estudio del impacto de un tratamiento crónico con eritropoyetina sobre la estructura y conectividad de las neuronas inhibitorias de la región CA1 del hipocampo, el balance excitación/inhibición, así como de estructuras relacionadas con la plasticidad En la presente tesis, se ha tratado de entender cómo un tratamiento crónico con la hormona eritropoyetina altera la estructura de las interneuronas somatostatina y parvalbúmina de la región CA1 del hipocampo, qué cambios ocurren con respecto a la neurotransmisión excitadora/inhibidora en esta región, su conectividad sináptica con las neuronas piramidales, así como cambios en la expresión de estructuras relacionadas con la plasticidad. Para llevarlo a cabo, ratones macho de 28 días de edad de la cepa Gin (denominados GAD-EGFP en esta tesis) han sido inyectados durante 3 semanas (5 IU/g in 0.01 ml) en días alternos, con un total de 11 administraciones con la hormona eritropoyetina. Tras 24 horas de la última inyección, los animales han sido sacrificados y sus cerebros procesados para los diferentes análisis. Estos ratones se caracterizan por expresar de forma constitutiva la proteína verde fluorescente (EGFP por sus siglas en inglés) en una subpoblación de interneuronas mayoritariamente somatostatina positivas (Oliva et al. 2000). En este trabajo, se muestra como el tratamiento crónico con eritropoyetina no produce cambios sobre la neurotransmisión excitadora e inhibidora. Sin embargo, alteraciones significativas pueden observarse al analizar la estructura de interneuronas somatostatina y parvalbúmina de la capa oriens de la región CA1 del hipocampo. Respecto a las interneuronas somatostatina de la capa oriens, estas interneuronas son principalmente células O-LM que inervan el árbol dendrítico distal de las neuronas piramidales y se caracterizan por la presencia de espinas dendríticas. Se observa una disminución en la complejidad del árbol dendrítico así como una disminución en la densidad de espinas dendríticas tras el tratamiento con eritropoyetina. Esta atrofia podría sugerir una menor superficie para la recepción de nuevos contactos sinápticos y una disminución de información excitadora que las células somatostatina reciben de las neuronas piramidales. Además, estas interneuronas establecen una proyección axónica en el estrato lacunosum-moleculare de CA1 donde hacen sinapsis sobre las dendritas de las neuronas principales. El estudio de la densidad de botones axónicos muestra una disminución tras el tratamiento con eritropoyetina. Una disminución en la densidad de botones se traduce en una disminución de la información inhibidora que ejercen las interneuronas somatostatina sobre las neuronas piramidales. Análisis similares se han llevado a cabo sobre neuronas parvalbúmina de la capa oriens de la región CA1. Tras el tratamiento con eritropoyetina, se observa una disminución en la complejidad del árbol dendrítico. Esto podría indicar una disminución en la entrada excitadora que reciben de las neuronas piramidales y, a su vez, una reducción en la inhibición que las interneuronas parvalbúmina ejercen sobre las neuronas piramidales. El análisis de espinas dendríticas no es posible debido a su ausencia en este tipo de interneurona. En este trabajo se muestra además como el tratamiento crónico con eritropoyetina produce una disminución en la densidad perisomática inhibidora sobre las neuronas excitadoras de la capa piramidal de la región CA1. En concreto se ha analizado la densidad de puncta perisomáticos provenientes de dos subpoblaciones de interneuronas en cesto, las interneuronas parvalbúmina y las interneuronas colecistoquinina que expresan CB1r en sus terminales axónicos. Cambios similares se observan en trabajos previos con el uso del antidepresivo fluoxetina (Guirado et al., 2014b). Por otra parte, se ha estudiado como dicho tratamiento afecta a la densidad de estructuras relacionadas con la plasticidad como son las PNNs y poliSia-NCAM. Contrariamente a lo que se pensaba, el tratamiento con eritropoyetina produce un aumento en la densidad de PNNs. Sin embargo, solo se observa un ligero aumento en la densidad de neuronas parvalbuminas rodeadas por PNNs, lo que sugiere que el aumento de PNNs podría estar asociado a otro tipo celular, probablemente neuronas excitadoras. Dado que la presencia de PNNs parece restringir los cambios plásticos, principalmente los asociados a las interneuronas parvalbúmina, el ligero aumento de células parvalbúmina rodeadas de PNNs podría explicar, en parte, la disminución de la arborización dendrítica y la inervación perisomática inhibidora observadas en este estudio. Finalmente, se muestra como el tratamiento con eritropoyetina produce un incremento en la expresión de poliSia-NCAM en las diferentes capas de la región CA1 del hipocampo. En el hipocampo, poliSia se asocia principlamente con subpoblaciones de interneuronas entre las que se incluyen las somatostatina y parvalbúmina. Estudios previos han visto como aquellas interneuronas que expresan poliSia-NCAM tienen una menor densidad dendrítica y menos contactos perisomáticos en comparación con las interneuronas que carecen de esta molécula (Gómez-Climent et al. 2011). El aumento en el nivel de expresión de poliSia-NCAM observado después del tratamiento con eritropoyetina, podría explicar la reducción en las características estructurales de ambas subpoblaciones de interneuronas estudiadas y también la disminución en la inervación perisomática inhibidora. CONCLUSIONES 1. El tratamiento crónico de ratones adultos con diazepam, un agonista de los receptores GABAA, disminuye la densidad de espinas dendríticas en la dendrita principal apical de las neuronas piramidales de capa V de la corteza cingulada. 2. El análisis neuroquímico usando VGLUT2 ha demostrado que la mayoría de los botones axónicos YFP+ de las capas I-II de la corteza cingulada tienen un origen extracortical. 3. El tratamiento crónico con diazepam, no produce cambios en la densidad de botones axónicos de las capas I-II de la corteza cingulada. 4. El tratamiento crónico con diazepam, usando una dosis ansiolítica pero no sedativa, no produce cambios en el nivel de ansiedad de los animales. 5. El fenotipo de las interneuronas GFP+ de las cortezas prelímbica e infralímbica es semejante en las cepas de ratones knock-out para ST8SIA2 y ST8SIA4, y en los ratones control. No hay un efecto producido por la depleción genética de las enzimas. 6. Basado en la expresión de proteínas de unión al calcio, las interneuronas GFP+ de las cortezas prelímbica e infralímbica coexpresan principalmente parvalbúmina y calbindina, y en menor proporción calretinina. 7. La depleción genética de ST8SIA4, pero no de ST8SIA2, disminuye la complejidad del árbol dendrítico de las interneuronas GFP+ de las cortezas prelímbica e infralímbica. 8. La depleción genética de cualquiera de las dos enzimas, ST8SIA2 o ST8SIA4, disminuye la densidad total de puncta perisomáticos que expresan parvalbúmina sobre el soma de las neuronas piramidales de las cortezas prelímbica e infralímbica. 9. La disminución en la densidad de puncta que coexpresan parvalbúmina y sinaptofisina sobre el soma de las neuronas piramidales, indica principalmente una reducción en la densidad de sinapsis activas. 10. El tratamiento crónico con eritropoyetina no altera el equilibrio excitación/inhibición en la capa oriens y radiatum de la región CA1 del hipocampo. 11. El tratamiento crónico con eritropoyetina en ratones jóvenes disminuye la complejidad del árbol dendrítico de las interneuronas somatostatina de la capa oriens de la región CA1 del hipocampo. 12. El tratamiento crónico con eritropoyetina disminuye la densidad de espinas dendríticas de las interneuronas somatostatina de la capa oriens de la región CA1 del hipocampo. 13. El tratamiento crónico con eritropoyetina disminuye la complejidad del árbol dendrítico de las interneuronas parvalbúmina de la capa oriens de la región CA1 del hipocampo. 14. El tratamiento crónico con eritropoyetina disminuye levemente la densidad de botones axónicos de las interneuronas somatostatina en la capa lacunosum-moleculare de la región CA1 del hipocampo. 15. El tratamiento crónico con eritropoyeina disminuye la densidad de puncta perisomáticos inhibidores que expresan parvalbúmina o CB1r sobre las neuronas piramidales de la capa piramidal de la región CA1 del hipocampo. 16. El tratamiento crónico con eritropoyetina aumenta la densidad de redes perineuronales y, levemente, la densidad de interneuronas que expresan parvalbúmina rodeadas por redes perineuronales en la región CA1 del hipocampo. 17. El tratamiento crónico con eritropoyetina aumenta la expresión de poliSia-NCAM en las capas oriens, radiatum y lacunosum-moleculare de la región CA1 del hipocampo.