Estudio estructural y funcional del mecanismo de transducción de señal por sistemas de dos componentes canónicos y atípicos

Resumen

Los organismos que viven en libertad están expuestos a una gran variedad de cambios ambientales y requieren el uso de maquinarias o sistemas capaces de percibir estos cambios y desencadenar respuestas adaptativas que permitan su supervivencia. Los sistemas de señalización y transducción de la señal basados en cascadas de fosforilación son los sistemas más comunes y, entre ellos, los Sistemas de Dos Componentes (TCSs) son los principales en organismos bacterianos. La capacidad de estos sistemas de controlar procesos tan importantes como resistencia a fármacos o patogénesis y tan diversos como aclimatación a condiciones de estrés o diferenciación y desarrollo, junto con su ausencia en el reino animal, dota a su estudio de gran importancia para la obtención de fármacos antibacterianos o para su uso en biotecnología. Los TCS prototípicos se basan en dos proteínas, una histidina quinasa (HK) dimérica transmembrana y un regulador de la respuesta (RR) citosólico. La parte N-terminal de las HKs se compone por una región variable extracelular que actúa como dominio sensor y que se dispone entre las hélices transmembrana, normalmente dos aunque pueden llegar a 20. La región intracelular se compone de dominios reguladores, que forman parte de alrededor de un 30% de las HKs, y de los dominios catalíticos altamente conservados, DHp y CA. El domino DHp, formado por dos hélices α y una conexión entre ambas, es la zona de dimerización de la proteína y contiene un residuo de His conservado que actuará como el primer residuo fosfoaceptor de la cascada de fosforilaciones del sistema. Por otro lado, el dominio CA es el dominio de unión de ATP que acerca al fosfato γ del ATP a la His fosfoaceptora para su fosforilación en la primera reacción de fosforilación del sistema, la autofosforilación. Posteriormente el grupo fosforilo es transferido a un residuo de Asp conservado en el dominio catalítico o REC del RR. Este proceso llamado fosfotransferencia requiere de la interacción entre la HK y el RR. La última de las reacciones es la desfosforilación del RR para finalizar la respuesta del sistema que puede darse de manera autosuficiente por parte del RR aunque normalmente se ve acelerada por la HK o por fosfatasas auxiliares. Este trabajo de Tesis se centra en el estudio tanto del mecanismo canónico de acción de los TCSs como de mecanismos de regulación menos conocidos en sistemas atípicos que permite conocer el proceso para su posterior utilización en biotecnología o en el diseño de fármacos antibacterianos. El estudio de la autofosforilación en las HKs nos permitió la resolución de la estructura de EnvZchim en estado de autofosforilación. Esto, junto con los estudios funcionales llevados a cabo con esta y otras HKs, nos ha permitido describir en detalle el proceso así como caracterizar tanto la asimetría como la direccionalidad cis o trans de la reacción. La localización de una región en el DHp de la HK clave en la interacción HK-RR, nos permitió además caracterizar el sistema atípico NblS-RpaB/SrrA-SipA el cual requiere de la interacción de su HK, NblS, con dos RRs canónicos RpaB y SrrA. La diferente especificidad que muestra esta HK por sus RRs se ha abordado en este trabajo mediante estudios in silico junto con la caracterización estructural de algunos de los componentes del sistema. Por otro lado, nuestros estudios en el proceso de activación y dimerización en los RRs canónicos OmpR y PhoB tras la obtención de la estructura del dominio REC del RR OmpR, nos ha permitido descifrar los residuos claves en la especificidad de la homodimerización en RRs canónicos tras su activación por fosforilación. Posteriormente, la utilización de genes reporteros controlados por el RR OmpR y el uso de citometría de flujo ha resultado ser una buena técnica para la detección posibles casos de heterodimerización entre RRs. En el estudio de TCSs atípicos, nuestros resultados con el sistema MaeK-MaeR confirmaron un sistema formado por una HK degenerada incapaz de autofosforilarse y por un RR cuya activación por fosforilación de manera canónica genera una dimerización tipo “swapped” apenas conocida en los RRs. Otro RR de interés fue NblR, un RR huérfano en cuyo mecanismo de activación, aún desconocido, hemos descifrado la importancia de dos Cys y una Tyr en su estado de activación, que posiblemente conlleva su oligomerización, para la regulación del promotor nblA. Nuestro trabajo en el conocimiento de los TCSs nos ha permitido conocer mejor el mecanismo de acción de estos sistemas y embarcarnos en la búsqueda de compuestos inhibidores de la autofosforilación en las HKs como posibles fármacos antibacterianos. Para ello, utilizamos ensayos cristalográficos y ensayos in vitro e in vivo sobre HKs modelo que nos permitan dar con el mejor compuesto antibacteriano.