Caracterización y mantenimiento in vitro de células germinales inducidas para la preservación de la fertilidad

Resumen

INTRODUCCIÓN La infertilidad es una condición clínica que afecta al 15% de las parejas en edad reproductiva; de los cuales un 28% se ven afectados por diferentes patologías que desembocan en la ausencia de gametos, dentro de este porcentaje se incluyen pacientes con fallo ovárico precoz, mujeres postmenopáusicas y pacientes masculinos diagnosticados de azoospermia no-obstructiva o cualquier otra patología que conlleve la ausencia de espermatozoides funcionales o, al menos, espermátidas elongadas que permitan su uso en tratamientos de reproducción asistida. Estas patologías producen infertilidad en el 1% de las mujeres y el 0.63% de los hombres, en la población general; como consecuencia el uso de gametos de donantes es caso obligado para estos pacientes. Además, aquellas parejas que sean portadores de cualquier trastorno genético con un alto riesgo de transmisión de enfermedades graves a su descendencia o pacientes con fallo recurrente en procesos de fecundación in vitro son considerados para terapias que implican donación de gametos. Es por ello que la generación in vitro de gametos artificiales puede ser una excelente oportunidad para estos pacientes con el objetivo de llevar a cabo sus deseos de ser padres teniendo su propia descendencia genética. Otro grupo de pacientes que podrían beneficiarse del uso de gametos artificiales son aquellos pacientes que han sido tratados de cáncer en su infancia y han desarrollado infertilidad secundaria al tratamiento contra el cáncer recibido en una etapa en la que no podían preservar sus propios gametos con anterioridad al tratamiento anti tumoral. Por último, existe un grupo poblacional que no sufre de infertilidad y que podría beneficiarse del uso de gametos artificiales generados in vitro; es el caso de parejas del mismo sexo, padres/madres solteras y mujeres post-menopaúsicas. Actualmente la única oportunidad de tener descendencia para este tipo de pacientes es el uso de gametos de donantes. Además del claro beneficio médico para los pacientes de reproducción asistida que subyace tras los modelos de generación de gametos artificiales, estos contribuyen a una mejor comprensión del proceso de especificación de la línea germinal en humanos puesto que se desconoce la base molecular debido a las restricciones éticas que hacen complicado trabajar con embriones humanos o realizar ensayos funcionales con células germinales obtenidas a partir de células madre pluripotentes o células somáticas; así como un mejor conocimiento en potenciales tratamientos de trastornos relacionados con la infertilidad y otras enfermedades genéticas que son susceptibles de ser transmitidas a la descendencia. Las células germinales son la fuente de variabilidad genética y responsables de producir el zigoto totipotente después de la fecundación a partir del cual comienza todo el proceso de embriogénesis. Durante este período la línea germinal se distingue como un grupo independiente de células conocidas como células germinales primordiales (PGCs de sus siglas en inglés). Los mecanismos que rigen la especificación de la línea germinal en el reino animal varía según el filo a considerar e incluso, en algunos casos, entre especies muy próxima entre sí. Así existen dos mecanismos principales que determinan la especificación de las PGCs en el reino animal: la herencia de determinantes citoplasmáticos (conocido como germoplasma o plasma germinal) y la especificación mediante señales extrínsecas de las células circundantes. Estas células germinales son cruciales en organismo con reproducción sexual para completar su ciclo vital, en concreto en mamíferos, la línea germinal se forma en el momento de la gastrulación a partir de un pequeño grupo de células fundadoras especificadas durante el desarrollo embrionario, estas células (las PGCs) escapan a su destino somático dado por el entorno físico en el que se encuentran dentro del embrión para adquirir un estatus germinal, que las dotará de unas características específicas que les permitirán llevar a cabo con éxito el proceso de meiosis y formar gametos haploides maduros y funcionales: óvulos y esperma. En los organismos con reproducción sexual son las células germinales las encargadas de transmitir la información genética a la descendencia cerrando así el ciclo vital a lo largo de las generaciones. La línea germinal en vertebrados es una población celular claramente separada de la línea somática, proceso que ocurre muy temprano durante el desarrollo embrionario. Estás células son especificadas mediante señales extrínsecas que activan un programa de transcripción concreto que desencadenará en la especificación de las células primordiales germinales. Estas señales externas, secretadas por el ectodermo extraembrionario, son básicamente BMP4 y BMP8 que indicen la expresión de Prdm1 y Prdm14, de forma dosis específica. En combinación con Tfap2c que se expresa en respuesta a Prdm1, esta tríada genética actúa reprimiendo la diferenciación a mesodermo y reforzando el destino germinal. A continuación, las PGCs realizan un proceso de migración hacia las gónadas indiferenciadas durante el cual experimentarán un proceso de reprogramación epigenética que es clave en la especificación de la línea germinal. Este proceso que se culmina una vez colonizadas las gónadas consiste en un borrado general de las marcas de metilación presentes en el ADN y representadas por la adición de un grupo metilo a ciertas Citosinas en posición 5 (5mC). Este borrado epigenético consiste en la modificación (hidroxilación) de las marcas de 5mC a 5hmC mediante las enzimas TET, modificación que las vuelve vulnerables a su eliminación. También colabora en este proceso el silenciamiento de las enzimas metiltransferasas que se encargan de la metilación de novo del ADN, como son DNMT3A y DNMT3B. El proceso de desmetilación global que experimenta la línea germinal es necesario para la activación de genes relacionados con meiosis, como son Dazl o Stra8, que junto con el microambiente adecuado dentro de la gónada dará lugar a la maduración de las células primordiales y su diferenciación a gametos funcionales. La meiosis consiste en dos divisiones sucesivas, primera división meiótica y segunda división meiótica, cada una de las cuales se puede dividir a su vez en cinco fases, profase, metafase, anafase, telofase y finalmente la citocinesis o separación de los citoplasmas. La segunda división se asemeja a una mitosis normal, es en la Meiosis I dónde subyacen los rasgos diferenciadores de este proceso, concretamente durante la Profase I. Esta subfase se puede subdividir a su vez en 4, leptoteno, zigoteno, paquiteno y diploteno. Durante la profase I se produce el fenómeno de recombinación cromosómica entre cromátidas no-hermanas de cromosomas homólogos, lo que generará variabilidad genética en la descendencia. A su vez en esta división se separan cada una de las copias de cromosomas homólogos generando así dos células haploides. El inicio de la meiosis es dependiente del ácido retinoico (AR) producido por las células del mesonefros circundante, en el contexto de la gónada femenina el AR desencadena la entrada en meiosis de los gonocitos, la cual se detendrá en Metafase I hasta que se vuelva a reiniciar en la pubertad (en algunos casos más tarde, como en el ser humano que se reinicia tras la fecundación por el espermatozoide). En la gónada masculina sin embargo la expresión de la proteína citocromo P450 CY26B1 por parte de las células de Sertoli embrionarias, degrada el ácido retinoico previniendo la entrada en meiosis de las células germinales. Estas, tras varias rondas de mitosis entran en un estado quiescente en fase G0 del ciclo celular. Esta proteína se expresa bajo el control del gen Sry que a su vez es esencial en la diferenciación de la gónada masculina. La expresión de este gen presente en el cromosoma Y desencadena la diferenciación de la gónada primitiva hacía testículo, la cual de otro modo estaría destinada a formar ovario. En la gónada diferenciada se produce una estrecha relación entre las células germinales y las células somáticas de soporte, en el caso del testículo son las células de Sertoli las encargadas de proporcionar el soporte físico necesario para la correcta maduración de los gametos. En el caso del ovario esta función la desempeñan las células de la granulosa. A su vez otro tipo de células somáticas acompañantes desempeñan una función clave en el funcionamiento de este órgano especializado que es la gónada; las más destacables son las células con función de producción de hormonas esteroideas, células de Leydig que producen testosterona en el caso de los testículos; y células de la teca que producen andrógenos que a su vez la granulosa transformará en estrógenos fundamentales en el desarrollo del ovocito. Gran parte del conocimiento acerca del desarrollo de la línea germinal en mamíferos viene derivado del estudio de modelos animales, principalmente el ratón, así como del desarrollo de modelos in vitro. Estos últimos son de gran relevancia tanto científica como clínica; científica porque nos permite el estudio de la especificación de la línea germinal en humano, que de otro modo sería inaccesible dada la dificultad para obtener material biológico de origen humano; clínica porque el poder desarrollar gametos artificiales in vitro abre la posibilidad de tener descendencia propia, a aquellos pacientes que no pueden producir sus propios gametos. Recientemente se ha avanzado mucho en este campo, los primeros ensayos acerca de generación de células germinales in vitro se basaban en protocolos de diferenciación a partir de cultivos de células embrionarias, al principio de forma espontánea y después forzando el proceso mediante la adición de citoquinas al medio. En la última década los protocolos de generación de células germinales in vitro se han optimizado enormemente, derivando en un proceso en varias en etapas, la primera de ellas sería inducir una población celular competente para responder a las señales que especifican la línea celular, lo que en el modelo murino se conoce como células de epiblasto-like (EpiLCs). Sobre esta población se inducen las PGC-LCs que a su vez podrán ser maduradas hacia espermatozoides u ovocitos dependiendo de las condiciones usadas. En este punto existen varias alternativas, se han intentado derivar mediante las condiciones de cultivo, mediante trasplantes in vivo, y mediante co-cultivo o agregación con células somáticas gonadales. En este último punto se ha alcanzado recientemente un hito puesto que se ha conseguido reproducir el ciclo completo de la línea germinal femenina in vitro en ratón; induciendo PGCLCs a partir de ESC e iPSCs y generando ovarios reconstituidos in vitro mediante agregación de estas PGCLCs con células somáticas aisladas de gónadas embrionarias que se cultivaron in vitro produciendo estructuras semejantes a folículos secundarios y ovocitos que pudieron ser fecundados y dieron lugar a descendencia fértil y sana. Todos estos trabajos ponen de manifiesto la importancia del nicho para lograr gametos totalmente maduros y funcionales y de ahí el interés de producir una gónada artificial in vitro. Las aproximaciones que han mostrado mejores resultados implican el uso de células somáticas gonadales aisladas de embriones, sin embargo, esto implica un obstáculo para su futura aplicación clínica. Una alternativa interesante sería la de producir células Sertoli o granulosa-like in vitro mediante reprogramación de otro tipo celular somático o a partir de células madre. ANTECEDENTES La derivación in vitro de células germinales a partir de células madre pluripotentes ha sido conseguida recientemente, así como la posibilidad de convertir directamente una línea somática específica en una completamente diferente mediante la sobreexpresión de factores clave. Resultados preliminares obtenidos en nuestro grupo de investigación mostraron que la combinación de seis factores específicos de la línea germinal era suficiente para reprogramar un cultivo de células somáticas humanas (46, XY) hacia células germinales-like inducidas (iGC-LCs). Estas células inducidas in vitro expresaban marcadores de espermatogénesis, entrada y progreso en meiosis y la capacidad de colonizar el nicho testicular después del xenotrasplante en ratón. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Basándonos en este conocimiento previo, la tesis doctoral que se presenta a continuación se basa en la hipótesis de que es posible inducir células germinales in vitro a partir de fibroblastos específicos de cada paciente recapitulando las características fenotípicas, transcriptómicas y epigenéticas de las células germinales, así como su capacidad para llevar a cabo el proceso de meiosis y formar, por ende, células haploides. Así mismo, y puesto que el nicho es fundamental para el desarrollo de estas células hacia gametos completamente maduros se ha propuesto un modelo de cultivo de tejido gonadal in vitro que permita un incremento en la eficiencia de producción de gametos maduros. Para poder contrastar la hipótesis formulada, se diseñaron los siguientes objetivos: Objetivo general: Estudiar nuevos protocolos para la caracterización, mantenimiento y maduración de las células germinales inducidas in vitro (iGC-LCs) obtenidas por reprogramación directa de células somáticas. Objetivos específicos: 1. Completar la caracterización de las iGC-LCs a nivel fenotípico, transcriptómico y epigenético. 2. Evaluar mediante técnicas moleculares la capacidad de las iGC-LCs para formar células haploides. 3. Desarrollar un modelo de nicho gonadal in vitro para el mantenimiento de la viabilidad de las iGC-LCs. METODOLOGÍA Para llevar a cabo esta tesis se ha partido de vectores de expresión lentivirales que contenían la secuencia codificadora consenso (CCDS) de seis factores relacionados con la línea germinal (PRDM1, PRDM14, LIN28A, DAZL, VASA y SYCP3, referida a partir de aquí como i6F); los sobrenadantes virales obtenidos en la línea celular HEK 293T se utilizaron para la transducción lentiviral de un cultivo de fibroblastos neonatales humanos (46, XY), mientras que como control negativo se utilizaron los lentivirus vacíos (condición MOCK). Para la inducción de las células germinales se empleó un medio enriquecido con factores de crecimiento previamente empleados en el mantenimiento in vitro de células madre espermatogoniales e implicados de algún modo en el proceso de gametogénesis. El óctel empleado incluye, LIF, GDNF, Forskolin, bFGF, 2-mercaptoetanol, SCF y ácido retinoico. Tras un proceso de reprogramación de catorce días se observan cambios morfológicos en la condición i6F con la formación de pequeñas colonias de células redondas. Se aíslan tres poblaciones diferentes para su evaluación: MOCK control, la población total reprogramada con la condición i6F, y las colonias i6F reprogramadas y manualmente aisladas. Así mismo y según el experimento, se aislaron a partir de estas colonias células individuales para su análisis a nivel de ploidía, y una población 1N mediante tinción con ioduro de propidio y FACS. Para la caracterización de las iGC-LCs a nivel fenotípico se llevó a cabo un análisis inmunocitoquímico de marcadores específicamente relacionados con la línea germinal (Tabla 1). Para la caracterización transciptómica se analizaron los niveles de expresión de genes implicados en la línea germinal mediante RT-qPCR (Tabla 2). La confirmación del borrado epigenético se llevó a cabo utilizando tres técnicas complementarias basadas en distintos principios, la detección inmunocitoquímica de los marcadores de metilación 5mC y 5hmC, los arrays de metilación y la conversión-secuenciación por bisulfito (Tabla 3). Para el análisis de generación de células haploides se emplearon dos aproximaciones moleculares de análisis de célula única, PCR para del gen de la AMELOGENINA y array de hibridación genómica comparada (aCGH). El modelo in vitro de nicho gonadal de explantes de tejido testicular tanto murino como humano, se abordó mediante el cultivo y mantenimiento de estos tejidos en medio basal alpha-MEM suplementado con KOSR o AlbuMAX. Las piezas tisulares se cultivaron sobre bloques de agarosa embebidas en este medio, creando así una interfase líquido-gas para la mejora de la supervivencia del cultivo de tejidos. Tras el tiempo de cultivo determinado en cada diseño experimental, las piezas de biopsia testicular se analizaron a nivel morfológico de visu, mediante histología con tinción hematoxilina-eosina, y a nivel transcriptómico mediante RT-qPCR para genes relacionados con la línea somática, pluripotencia y estadíos tempranos y tardíos de la línea germinal (Tabla 4). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados obtenidos en este proyecto de tesis valida el protocolo de reprogramación directa de células somáticas mediante el uso de 6 factores relacionados con la línea germinal (i6F) para la obtención de células iGC-LCs con fenotipo germinal in vitro. Estas células se caracterizan por formar colonias de células redondas en cultivo (Figura 17), que expresan marcadores de células primordiales germinales tempranas, tales como CDH1, SOX17, TFCP2L1 y Brachyury (Figura 21). Así mismo, la co-localización de los marcadores espermatogénicos UTF1, PLZF, VASA, DAZL y HIWI, lo que refuerza la existencia de una población pre-meiótica en las colonias de iGC-LCs (Figura 20). La presencia de células germinales en diferentes estados de diferenciación puede ser debida a la aleatoridad de la internalización de las particulares lentivirales portadoras de los distintos factores de reprogramación durante el proceso de transducción, y la sobreexpresión simultanea de factores relacionados con estadíos diferentes en el desarrollo de la línea germinal; así como, la introducción a tiempo inicial del ácido retinoico en el medio de cultivo, que está forzando a las células hacia la entrada en meiosis. Las iGC-LCs derivadas in vitro mostraron una correcta reprogramación epigenética propia del proceso de especificación de la línea germinal en mamíferos. Este hecho se pone de manifiesto por los cambios en el porcentaje de metilación de las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) estudiadas (H19, SNRPN, PEG3 y KvDMR1); que adoptan un perfil correspondiente al de un gameto femenino (Figura 23). Este proceso de reprogramación epigenética viene acompañado de un borrado general de la metilación representado por la hidroxilación del grupo metilo en posición 5 de algunas citosinas. El paso de 5mC a 5hmC es por tanto un indicio del proceso de borrado epigenético. El estudio de estas marcas epigenéticas se ha llevado a cabo mediante inmunocitoquímica (Figura 24). Finalmente, para completar la caracterización de las células iGC-LCs, se obtuvieron células individuales manualmente aisladas de las colonias de iGC-LCs, y se evaluó la presencia de células haploides mediante dos técnicas moleculares distintas. La primera técnica consistió en la evaluación del gen de la AMELOGENINA, un gen asociado a los cromosomas sexuales que difiere en tamaño entre el cromosoma X e Y, de modo que según el tamaño de banda obtenido en la PCR se puede deducir si la célula analizada presenta un cromosoma X, un cromosoma Y, o ambos cromosomas sexuales XY al igual que las células somáticas usadas para la reprogramación (Figura 25). Finalmente, se utilizó una técnica de diagnóstico genético preimplantacional (aCGH) para la evaluación del contenido cromosómico total en células individuales iGC-LCs. El array de CGH ofrece una herramienta de análisis de la ploidía mucho más exhaustiva puesto que presenta la capacidad de analizar todo el conjunto de cromosomas de una sola vez (Figura 26). A pesar de la baja eficiencia del proceso, ambas técnicas indican que hay una media de 1-3% de células haploides en las colonias generadas por reprogramación in vitro. Finalmente, y dada la importancia del nicho para el correcto desarrollo y maduración de las células germinales se ha propuesto un modelo in vitro para el mantenimiento de este microambiente con el fin de emplearlo para generar gametos funcionales a partir de los progenitores germinales previamente inducidos in vitro. Se mantuvo el tejido cultivado in vitro hasta 4 semanas en el caso del modelo murino, con una morfología normal en base a la estructura de los túbulos seminíferos (Figuras 27 y 32). Sin embargo, ninguna de las condiciones testadas fue capaz de iniciar el proceso de espermatogénesis in vitro. El cultivo de muestras humanas mostró una mayor dificultad a la hora de mantener su viabilidad a largo plazo (Figura 38), aunque sí es posible el mantenimiento de la población indiferenciada de la línea germinal. CONCLUSIONES 1. La reprogramación directa de células somáticas mediante expresión ectópica de seis factores transcripcionales relacionados con la línea germinal (PRDM1, PRDM14, LIN28A, DAZL, VASA y SYCP3) resulta en la formación de colonias de células germinales inducidas (iGC-LCs) que muestran características morfológicas y fenotípicas propias de células germinales. 2. Las colonias de iGC-LCs generadas in vitro están compuestas de un conjunto heterogéneo de poblaciones celulares germinales en distintos estadios de diferenciación que expresan genes de especificación germinal tempranos, pre-meióticos y post-meióticos, tal y como muestra la expresión de estos marcadores analizada mediante RT-qPCR. 3. Las iGC-LCs son capaces de iniciar y completar el proceso de meiosis y producir células haploides, tal y como sugieren los resultados del análisis molecular mediante PCR de AMELOGENINA y array de hibridación genética compada (aCGH), sobre célula única. El aCGH, técnica molecular que permite el análisis de la totalidad de los cromosomas, mostró una eficiencia de generación de células haploides entre 1-2% de la población de iGC-LCs. 4. El análisis epigenético de células haploides (post-meióticas) aisladas de las colonias de iGC-LCs mostró una pérdida de metilación en las regiones diferencialmente metiladas (DMRs) de impronta paterna y un aumento en los DMRs maternos, que correlaciona con un fenotipo ovocitario. 5. El cultivo en interfase gas-líquido de tejido testicular de ratones neonatos demostró la capacidad para mantener la estructura del tejido in vitro, así como el mantenimiento de la población germinal endógena, pero no su progreso hacia gametos maduros, tal y como muestran los resultados de expresión génica de marcadores de pluripotencia, germinales, post-meióticos y somáticos. 6. El mantenimiento de tejido testicular humano para la maduración de células germinales primordiales no es viable a largo plazo en las condiciones testadas. La adición de ciertos factores de crecimiento y hormonas podría contribuir a una mejor simulación del nicho gonadal que permitiera la maduración de progenitores germinales obtenidos in vitro y su progresión en meiosis para producir gametos artificiales funcionales. 7. Este estudio demuestra que se pueden generar iGC-LCs in vitro, aunque con baja eficiencia; así mismo, se requiere más conocimiento sobre la generación de un nicho gonadal in vitro capaz de acoger y colaborar en la maduración de estas células para mejorar la eficiencia de generación de gametos artificiales funcionales.