Estudio inmunohistoquímico y biología molecular de la transición epitelial-mesenquimal en los sarcomas sinoviales

Resumen

Introducción La transición epitelial-mesenquimal (EMT) es un fenómeno en el que las células epiteliales pierden sus estructuras de unión, comienzan a expresar proteínas mesenquimales, remodelan su matriz extracelular facilitando su migración (1). Inicialmente, la EMT fue reconocida como un proceso fisiológico en la embriogénesis (2). Posteriormente se ha demostrado que la EMT aberrante contribuye a las propiedades invasoras y metastásicas de las células neoplásicas mediante inactivación de la E-cadherina que es una molécula de adhesión celular que juega una función central en el mantenimiento de la integridad epitelial (3). Esto representa la implicación de la EMT en la carcinogénesis (3) La morfología y la integridad de las unidades epiteliales son mantenidas por la E-cadherina y sus proteínas de anclaje que incluyen las cateninas (¿, ß y ¿) las cuales están asociadas al dominio citoplasmático de la E-cadherina (4). El defecto o la pérdida de la proteína E-cadherina puede ser el resultado de una serie de fenómenos que incluyen la hipermetilación del promotor (5), mutaciones (6), modificación postraslacional anormal (fosforilación o glucosilación) (1) o degradación proteica (proteolisis) (1), todas estas pueden de una forma u otra inducir propiedades invasores o metastasicas en las células neoplásicas. Adicionalmente, la inactivación de la E-cadherina puede ocurrir por activación de sus represores como Snail (7), Slug (8), Sip1 (9), Twist (10) y Ets (11). La familia de los factores de transcripción Snail esta implicada en el desarrollo embriológico, diferenciación mesodérmica, desarrollo de la cresta neural, apoptosis y EMT neoplásico (12). La sobre-expresión de Snail y Slug causa inactivación de la E-cadherina en la EMT, sin embargo la represión de la formación de ARNm de Snail y la resultante activación de la E-cadherina induce la transición mesenquimal-epitelial (MET) (1), lo opuesto de la EMT. La interacción de múltiples vías de señales de transducción que están involucradas en la EMT neoplásica incluyen factor de crecimiento transformante-beta (TGF-ß) (13), Wnt (14) y la fosfatidilinositol 3-quinasa / AKT (PI3/AKT) (13), receptor tirosina quinasa (15), Notch (16) y la quinasa unida a la integrina (17).Además de ser una molécula de adhesión celular, la ß-catenina es un activador transcripcional de los puntos terminales de la señalización de la vía Wnt mediante la formación de complejos con las proteínas de uniones al DNA como los factores de transcripción de células T (TCF) y activadores linfoides (LEF) (18,19). El producto génico de la poliposis adenomatosa coli (APC) regula el nivel de ß-catenina en cooperación con la glucógeno sintasa quinasa 3ß (GSK3ß) fosforilando múltiples residuos de serina treonina codificado por el exon 3 de la ß-catenina (20,21). Wnt/ ß-catenina induce EMT mediante la activación de Slug (blanco transcripcional al directo de ß-catenina/Tcf) y la estabilización del Snail a través de la inhibición de su fosforilación y degradación (14). La quinasa oncogénica serina/treonina, AKT, inicialmente descrita como un oncogén (22) participa en la proliferación celular, progresión del ciclo celular así como la EMT. La producción de AKT en las células epiteliales conlleva a dos efectos fundamentales en el estado de la E-cadherina: el primero consiste en la represión de la transcripción de E-cadherina, probablemente debido a la activación de la expresión del Snail. Por otro lado, mínimas cantidades de E-cadherina producida por la célula se concentra en los organelos perinucleares debido a una activación AKT de la proteína Rab5 (23). TFG- ß estimula la fosforilación de la AKT mediante la interacción cruzada con PI3K (13). Este estimulo culmina en una EMT evidente caracterizado por la reorganización de fibras de actina y localización alterada de la E-cadherina y la proteína de unión rígida ZO-1 generando la transición de una morfología cuboide a una fusiforme (23). Los sarcomas sinoviales son tumores mesenquimales primitivos clásicamente subdivididos como bifásico (BSS) constituido por estructuras glandulares en un fondo predominante de células fusiformes; la variante monofásica fibrosa (MFSS) que muestra una morfología celular totalmente fusiforme. Una variante relativamente poco frecuente es el denominado sarcoma sinovial pobremente diferenciado (PDSS) compuesto por células redondas primitivas que traducen un fenotipo indiferenciado. Aunque el origen celular del SSs es incierto, el descubrimiento de la translocación cromosómica balanceada t(X;18)(p11.2;q11.2), generando la fusión del SYT (también conocido como SS18) con SSX1, SSX2 (en mas de un 90% de los casos) o raramente con el SSX4 ha contribuido intensamente a la comprensión de la tumorogenesis en el SS (16). Este evento crítico se observa tanto 11 en el elemento glandular como en el fusiforme indicando su evolución clonal. Sin embargo, aun están por establecer evidencias cruciales en la histogénesis lo que ha provocado que en el momento actual este tumor este considerado como una neoplasia de diferenciación incierta. La coexistencia curiosa de dos componentes celulares en el SS nos ha motivado para investigar la asociación entre los subtipos histológicos y la EMT neoplásica. Para cumplimentar este objetivo decidimos estudiar la correlación entre los subtipos histológicos de SS y la expresión y estatus mutacional de las moléculas críticas implicadas en la EMT como la E-cadherina, moléculas de la vía de señalización Wnt y PI3K/AKT en los tumores primarios y xenotrasplantes. La t(X;18)(p11.2;q11.2) esta establecida como el evento patogénico primario en la evolución de los diferentes subtipos de SS. Sin embargo los mecanismos moleculares que contribuyen a la complejidad de la histología, continúan siendo intrigantes para los patólogos, biólogos moleculares y citogenetistas y los científicos básicos. El origen celular de esta neoplasia es enigmático y hasta el momento actual no hay evidencias concretas en este campo. La alteración de proteínas de las vías oncogénicas como Wnt, TGF-ß, PI3K/AKT esta implicada en la transformación de células epiteliales a mesenquimales contribuyendo a su potencial metastático. El efecto total de estas alteraciones se refleja en el estado de expresión de E-cadherina cuya pérdida resulta en la adquisición del fenotipo fusiforme. Estas alteraciones proteicas y su relación con la E-cadherina se han caracterizado en otras neoplasias epiteliales utilizando estudios in vitro con líneas celulares. En el presente estudio planteamos la hipótesis de que la expresión de moléculas de Wnt y PI3K/AKT y su relación con la expresión de Ecadherina puede estar asociada con el desarrollo de subtipos histológicos en SSs. Hipótesis y Objetivos 1. Realizar una evaluación inmunohistoquímica de la expresión de E-cadherina y sus moléculas relacionadas pertenecientes a las vías Wnt (ß-catenina, GSK3 ß/pGSK3 ß) y PI3K/AKT (AKT/pAKT y PI3K) en los SSs usando material embebido en parafina ordenados en matrices de tejidos titulares. 2. Los resultados de inmunohistoquímica de las moléculas anteriores se correlacionaran con la expresión de E-cadherina en los subtipos histológicos de SSs. 3. Análisis del estatus mutacional de E-cadherina, ß-catenina y APC para definir su asociación con las variantes histológicas. Para cumplimentar los objetivos utilizaremos los siguientes modelos tisulares: 1. Sarcomas sinoviales primarios: Un grupo de 41 SSs genéticamente bien caracterizados con confirmación de la fusión SYT-SSX será incluido en una micromatriz de tejido. Adicionalmente también se incluirán en 16 casos de SS con material tumoral congelado. Este modelo de tumores primarios seria útil para establecer la frecuencia global de las diferentes aberraciones (expresión proteica y alteraciones genéticas) de las moléculas dianas implicadas en la EMT en el SS. 2. Tumores primarios y sus xenotrasplantes correspondientes: Este tipo de evaluación paralela de los tumores originales y los xenotrasplantes será empleado para cumplimentar los siguientes objetivos: primero, observar si existe variación histológica entre el tumor original y los pases en los xenotrasplantes. Segundo, basado en la hipótesis de la carcinogénesismultistep donde en cada paso se adquieren alteraciones genómicas adicionales que confieren una ventaja en el crecimiento a las células dianas, decidimos investigar si existen alteraciones en la expresión y mutaciones de moléculas de EMT que se encuentran en el tumor original y si estas alteraciones se mantienen durante los pases sucesivos o aparecen nuevas alteraciones moleculares debido a una selección clonal. Resultados Entre los tumores primarios, en los MFSSs, una expresión elevada de Snail (17/27, 63%), Slug (18/27, 67%), disadherina (14/27, 52%), activación de Wnt (acumulación núcleocitoplásmica de ß- catenina en 63%, n=27 y expresión positiva de GSK3ß y pGSK3ß en 24/27, 89% y 21/27, 78%, respectivamente) estuvo correlacionado significativamente con la inactivación de E-cadherina (1/27, 4%) (Todos los p<0.05). En contraste, la expresión intacta de E-cadherina (12/14, 86%) en el 13 componente glandular de BSSs estuvo asociada con una disminución significativa de la expresión de Snail (3/14, 21%) (p=0.002) y disadherina (2/14, 14%) (p<0.001). La señalización PI3K/AKT apareció inactivada consistentemente en ambos subtipos histológicos independientemente del estado de la E-cadherina. Dos de los 16 (12.5%) SSs mostraron mutaciones de sentido erróneo de la ß-catenina. Ambos tumores eran MFSS (2/9, 22%). Las dos mutaciones (41: ACC-ATC and 41: ACC-GCC) que ocurrieron en el codon 41 del exon 3 de la ß-catenina. In contraste, todos los BSSs (n=4) y PDSSs (n=3) mostraron secuencias nativas de ß-catenina. Todos los SSs a pesar del subtipo histológico han mostrado secuencias nativas de APC. La mutación de E-cadherina fue detectada solo en un caso (1/16, 4.5%) siendo el patrón histológico tipo bifásico. No existió correlación significativa entre la pérdida de expresión de E-cadherina y el estado mutacional de E-cadherina, ß-catenina y APC en las dos tipos histológicos de SSs. Adicionalmente, la frecuencia de acumulación aberrante nucleocitoplásmica de ß-catenina y la expresión de otros mediadores Wnt fue superior comparada con la rara incidencia de mutación de ß-catenina y APC sugiriendo la existencia de mecanismos alternativos de activación de Wnt en la tumorogenesis de los SSs En el modelo de xenotrasplante, los SSs primarios adquirieron un fenotipo indiferenciado durantes los pases sucesivos indicando la variabilidad fenotípica. Sin embargo, las mutaciones de la E-cadherina y ß-catenina detectada en los tumores primarios se mantuvieron en todos los pases de los xenotrasplantes. Adicionalmente, no se detectaron nuevas mutaciones de estos genes en los xenotrasplantes. Estos hallazgos sugieren la estabilidad genética en el modelo tumoral en ratones Propuesta conceptual de EMT en SS Nuestros resultados demuestran que la inactivación de E-cadherina asociada con el aumento de la expresión de Snail, Slug, disadherina y la activación de Wnt es detectada en las células fusiformes de los MFSSs, Basado en la escasa frecuencia de mutaciones de la E-cadherina en SSs, parecer ser que la inactivación de la E-cadherina no ocurren predominantemente por mutaciones génicas. Por otro lado el aumento de la expresión de Snail, Slug esta correlacionado con pérdida de la expresión de E-cadherina sugiriendo un mecanismo patogénico de inactivación de E-cadherina como causa posible de la ausencia de diferenciación epitelial y la adquisición de un fenotipo fusiforme en los MFSSs. Asimismo, la baja frecuencia de mutaciones de ß-catenina y la ausencia de las mutaciones de APC comparado con la elevada frecuencia de expresión aberrante de ß-catenina sugieren que ni las mutaciones de ß-catenina ni de APC han contribuido a la activación de la vía Wnt en este subtipo histológico. A pesar de que esto no es una prueba de causa/ efecto, los resultados inmunohistoquímicos generados en este estudio apoyan la hipótesis de que la EMT neoplásica es un factor que contribuye a la morfología fusiforme en los MFSSs. Nuestro estudio aporta las bases para futuros experimentos moleculares relacionados con la biología de la EMT en los SSs así como en los tumores que exhiben complejidad multifenotípica. Conclusiones I- Sarcomas sinoviales primarios. 1-La inactivación de la E-cadherina se observa en las células fusiformes de los sarcomas sinoviales fibrosos monofásicos, sin embargo los elementos epiteliales del subtipo bifásico muestran expresión intacta de E-cadherina sugiere que la transición epitelialmesenquimal neoplásica esta asociada en el desarrollo del subtipo histológico MFSS. 2- El aumento de la expresión de Snail y Slug contribuyen a la inactivación de Ecadherina en las células fusiformes del MFSS sugieriendo un posible mecanismo alternativo de inactivación de E-cadherina con la consecuente inducción EMT en este subtipo de SS. En contraste, la escasa o ausente expresión de Snail y Slug en los elementos epiteliales de los BSSs puede ser responsable de la preservación intacta de la E-cadherina y del mantenimiento de la configuración glandular. 3- La expresión de disadherina esta correlacionada significativamente a la perdida de la E-cadherina en las células fusiformes de MFSSs sugiriendo su implicación en la EMT neoplásica. 4- La escasa frecuencia de mutaciones de la E-cadherina detectada en los SSs sugiere que la mutación del gen no es un factor predominante en la pérdida de la función proteica. 5- La activación de la vía Wnt demostrada por la expresión aberrante de ß-catenina y otros mediadores Wnt como GSK3 ß parecer estar asociado con la pérdida de E-cadherina en las células fusiformes de MFSSs sugiriendo la posible asociación de la activación Wnt en la inducción de EMT. 6-Las mutaciones de ß-catenina y APC constituyen eventos infrecuentes en los SSs y no están asociados directamente con la frecuente expresión aberrante nucleocitoplásmica de ß-catenina, sugiriendo que la actividad aberrante de ß-catenina pudiera ser inducida por otros mecanismos independientes de mutación génica. 7-Las señalización de la vía PI3K/AKT esta consistentemente activada en el SSs, independientemente del estatus de E-cadherina. II- Sarcomas sinoviales xenotrasplantados en ratones atímicos. 1-Los SSs primarios xenotrasplantados en ratones atímicos mostraron una transformación morfológica hacia un fenotipo indiferenciado de células redondas con incremento del número de mitosis y necrosis lo que sugiere una evidente variabilidad fenotípica. 2-La identificación de t(X;18) detectada por FISH o RT-PCR en los tumores primarios y los correspondientes xenotrasplantes confirma la estabilidad genética de la t(X;18) a pesar de los cambios morfológicos progresivos observados a nivel fenotípico. 3- Los sarcomas sinoviales no ganaron mutaciones adicionales en los genes relacionados con la EMT durante los pases sucesivos en xenotrasplantes. 4- El análisis basado en xenotrasplantes proporciona material tumoral con características genéticas estables lo que sugiere la confiabilidad de este modelo en el estudio de alteraciones genéticas así como para diversos estudios de la biología tumoral. Nuestro análisis basado en modelo de xenotrasplante sugiere la confiabilidad de este modelo para el estudio de alteraciones genéticas y proporciona References 1. Larue L, Bellacosa A. Epithelial-mesenchymal transition in development and cancer: role of phosphatidylinositol 3' kinase/AKT pathways. Oncogene. 2005;24;7443-7454. 2. Nieto MA, Sargent MG, Wilkinson DG, Cooke J. Science 1994;264(5160):835-839 3. Thiery J-P, Sleeman JP. Complex networks orchestrate epithelial mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol 2006; 7(2):131-142 4. Ozawa M, Baribault H, Kemler R. The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species. EMBO J. 1989;8;1711-1717. 5. Saito T, Oda Y, Kawaguchi K, et al. E-cadherin mutation and Snail overexpression as alternative mechanisms of E-cadherin inactivation in synovial sarcoma. Oncogene. 2004; 23;8629-8638. 6. Saito T, Oda Y, Sugimachi K, et al. 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