Clonacion y estudio del gen caprb1 de candida albicans

Resum

Como aproximación al estudio del dimorfismo se utilizó el despliegue diferencial de fragmentos de cDNA (differential display) aislandose cinco fragmentos de los cuales solamente tres: Frag 24, Frag 53 y Frag 127 eran dependientes de las condiciones inductoras de la miceliación, si bien el resto: Frag 16 y Frag 59 se expresaba mayoritariamente bajo tales condiciones. Solo uno de los clones originados, el DD53 (procedente del cDNA Frag 53) presentó una homología significativa con proteínas existentes en la base de datos, siendo de un 84% de similitud (65% de identidad) con determinadas zonas del gen PRB1 que codifica la proteasa B vacuolar de S. Cerevisiae. El inserto de cDNA fue liberado mediante digestión enzimática con EcoRI y se utilizó como sonda en el rastreo de la genoteca genómica C9, con el propósito de aislar un clon que contuviese el gen entero. El fragmento Hindlll-Xbal del clon 5b que contenía el gen completo fue secuenciado y su secuencia nucleotídica reveló la existencia de una única pauta abierta de lectura de 1395 pb que codificaba una proteína de 465 aa, homóloga a la proteasa B de S. Cerevisae y similar a miembros de la superfamilia de las subtilisín-serín-proteasas, concretamente de la familia de las proteinasas K. Estudios sobre la regulación del gen evidenciaron que CaPRB1 está sujeto a represión catabólica por nitrógeno pero no por glucosa y que no está implicado en morfología ni en la transición dimórfica, al menos bajo las condiciones estudiadas. Los resultados obtenidos sugieren que su expresión está relacionada con el estrés nutricional por NAGA, potenciado por el estrés térmico. Estudios de localización cromosómica en las cepas CA/4 y SC5314 revelaron la presencia del gen en el cromosoma 2. La interrupción génica utilizando la técnica "ura-blaster" permitió la obtención secuencial de los mutantes mono y dialélicos en su versión auxótrofa y protótrofa, sin que