Nuevos inhibidores del intercambiador na+/h+acción de la halocina h6 y del peptido inhibidor pinhe en células de mamifero

Resumen

A partir del sobrenadante del cultivo de la haloarquea Haloferax gibbonsii Ma 23.39 se obtiene la halocina H6 que inhibe el intercambiador Na+/H+ de haloarqueas sensibles. Este intercambiador es vital para estas células que viven en ambientes hipersalinos y lo precisan para mantener la homeostasis del Na+. Una purificación del sobrenadante del citado cultivo de H.gibbonssi sobre la base de la precipitación con acetona y FPLC en fase reversa con gradiente de acetonitrio permite purificar un péptido que conserva toda la actividad de H6. Este péptido, PINHE, tiene un peso molecular de 2732 Da y está formado por 28 aminoácidos. Se trata de un péptido hidrófobo y termorresistente, soporta rangos amplios de pH, su actividad es independiente de la concentración salina y es sensible a pronasa y resistente a tripsina. Sobre la base del objetivo principal del presente trabajo de determinar si tanto H6 como PINHE inhiben elintercambiador NHE de eucariotas se desarrolló un modelo de ensayo para determinar la actividad de NHE. Dicho modelo se basó en producir una acidificación del citoplasma de células de mamíferos conpulsos de ácido propiónico y seguir la evolución del pHi (intracelular) por citometría de flujo. Se bloquearon otros transportadores implicados en la regulación de pHi (NCS y NDAE). La actividad de NHE se calculó sobre la base de determinar la velocidad inicial de recuperación de pHi a partir del ajuste matemático de los datos experimentales. Todas la células utilizadas: fibroblastos de ratón NIH3T3, embrionarias de riñón humano HEK293, cardiomiocitos de ratón HL-1 y cultivos primarios de músculo esquelético humano respondieron al modelo experimental propuesto de forma similar. Tanto H6 como PINHE inhiben el NHE de células de mamífero. PINHE inhibe de forma específica y reversible el NHE. Esta inhibición es dependiente de la concentración de PINHE pudiendo calcularse una concentración inhibitoria del 50%