Identificación de genes implicados en la respuesta a estrés en la levadura saccharomyces cerevisiae y análisis de las potencialidades biotecnológicas de su manipulación

Resumen

En este trabajo se han abordado diferentes estrategias para avanzar en el conocimiento de la función y la regulación del gen SPI1, además de las de algunos de los genes que se han encontrado como implicados en la misma. Para ello ha sido fundamental el desarrollo de dos estrategias de rastreo genético. Los resultados obtenidos muestran que la inducción de SPI1 en condiciones de limitación de nutrientes está regulada por los factores transcripcionales Sok2p, Phd1p y Msn2/4. También serían necesarios para la expresión correcta de dicho gen la RNasa Pop2p y la proteína quinasa Yak1p. Además, mediante los estudios de rastreo genético, sabemos que su expresión está regulada por la concentración de triptófano y la presencia de proteínas implicadas en la síntesis y el transporte del mismo (Tat1/2p y Trp1p), además de ser relevante el papel de los genes YCP4, MSS4 y HOR2. También se estableció una relación entre la ruta de integridad celular y la expresión del gen. Se ha caracterizado el papel de RSP5, BUL1 y BUL2 en la regulación de SPI1. Se observó que los mutantes en estos genes, en determinadas condiciones adversas presentan mayor sensibilidad que las correspondientes cepas silvestres. Se detectó además que mutantes en RSP5 o en BUL1/BUL2, presentaban menor expresión de SPI1. Mediante estudios globales, se estudió el papel de RSP5 en la regulación de la expresión génica en condiciones de limitación de nutrientes, observándose su implicación en la regulación transcripcional de genes relacionados con la traducción y en genes de pared celular (con mayores niveles en el mutante), así como de genes de respuesta a estrés y del metabolismo y transporte de aminoácidos (que presentan menores niveles en el mutante). Además, varias proteínas de la maquinaria de ubiquitinación están implicadas en la regulación de SPI1 en condiciones de limitación de nutrientes. Ubc1p, Ubp6p y Ubp14p son necesarias para la activación del gen, mientras Ubc4p, Ubc6p y Ubp6p tienen un papel negativo en su regulación. Por otro lado, Rsp5p está implicada en la formación de cuerpos de procesado de RNA, ya que su mutante HPG1-1 es defectivo en la formación de estas estructuras. También se encontró durante este trabajo que el gen YCP4, otro de los identificados en nuestros rastreos genéticos, así como su homólogo RFS1, están implicados en la regulación del gen SPI1. Además se observó que mutantes en estos genes eran sensibles a determinadas condiciones de estrés. Los estudios globales llevados a cabo con el mutante ycp4Drfs1D muestran que YCP4 y RFS1 están implicadas en el control transcripcional positivo de los genes que participan en el metabolismo de aminoácidos, reproducción sexual, citoquinesis y transporte transmembrana. Por otro lado, regulan negativamente el metabolismo energético y mitocondrial, la traducción y la función ribosomal, así como la biosíntesis de ácidos grasos. Finalmente se han aplicado los conocimientos sobre regulación de SPI1 para su uso biotecnológico. La sustitución del promotor de una de las copias del gen que codifica el factor transcripcional de respuesta a estrés Msn2p en una cepa vínica de uso industrial, da como resultado una cepa genéticamente modificada (T73S) con determinadas características deseables en este tipo de cepas. Así, T73S es resistente a determinadas condiciones de estrés, crece mejor en medios con fuentes de carbono no fermentables, y presenta mayores niveles de expresión de MSN2 y de algunos genes con STREs en varias condiciones de estrés y durante la vinificación. Además, presenta mayor viabilidad o velocidad de consumo de azúcares en determinadas fases del crecimiento, coincidiendo parcialmente con la mayor expresión de genes de respuesta a estrés.