Estudio de la susceptibilidad y resistencia frente a bacillus thuringiensis en diferentes colonias de spodoptera exigua

Resumen

Spodoptera exigua o gardama (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) es una plaga polífaga ya que pude alimentarse de una gran variedad de plantas y está ampliamente distribuida en todo el mundo. Actualmente, se están empleando diferentes insecticidas químicos para controlar esta especie, sin embargo los insecticidas de tipo químico no son una alternativa muy segura, ya que éstos son contaminantes y peligrosos para animales beneficiosos y humanos. Una de las mejores alternativas frente al uso de insecticidas químicos es el uso de los productos basados en Bacillus thuringiensis. Ésta es una bacteria Gram positiva que durante la fase de esporulación produce unas proteínas insecticidas (denominadas proteínas Cry) que son muy específicas contra diferentes especies de insectos. Para la realización del presente trabajo se plantearon dos objetivos principales, (1) caracterización de la susceptibilidad de esta especie frente a diferentes proteínas Cry y a los componentes del aislado natural de B. thuringiensis variedad kurstaki. HD-1 (Btk HD-1); (2) caracterización de los mecanismos de resistencia a B. thuringiensis. La caracterización de la susceptibilidad de S. exigua frente a diferentes proteínas Cry de B. thuringiensis se determinó mediante el análisis de 9 proteínas Cry tóxicas para lepidópteros. Para ello se empleó una colonia de S. exigua de laboratorio (FRA) y se determinaron dos parámetros diferentes: mortalidad e inhibición de crecimiento. Además, la variabilidad de la susceptibilidad intraespecífica se analizó para 3 colonias más de laboratorio (HOL, MUR, ALM) mediante ensayos de mortalidad. Los resultados obtenidos mostraron que las proteínas Cry1Ca, Cry1Da y Cry1Fa son tóxicas para S. exigua, mientras que otras proteínas como: Cry1Aa, Cry1Ab y Cry1Ac son marginalmente tóxicas y las proteínas Cry1Ba, Cry2Aa y Cry2Ab no son tóxicas para esta especie. Los patrones de susceptibilidad obtenidos para las diferentes colonias fueron más similares para las colonias FRA, MUR y ALM, mientras que la colonia HOL mostró diferencias de susceptibilidad para las proteínas Cry1Ab y Cry1Da. Los ensayos de inhibición de crecimiento, realizados en la colonia FRA, mostraron un patrón de toxicidad diferente al observado en los ensayos de mortalidad. Observándose que algunas proteínas consideradas como no tóxicas a nivel de mortalidad (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac y Cry2Aa) producían una inhibición de crecimiento similar a la observada para proteínas tóxicas (Cry1Ca, Cry1Da y Cry1Fa). El cultivo esporulado de la cepa Btk HD-1 es el principal componente activo de varios de los productos comerciales que se están empleando actualmente para el control en campo de larvas de S. exigua. El análisis de toxicidad y sinergismo del cultivo esporulado de ésta cepa y de sus componentes se realizó mediante ensayos de mortalidad. Los resultados pusieron de manifiesto que existe una interacción sinérgica entre los diferentes componentes del cristal paraesporal y la espora. Debido a que el número de proteínas Cry tóxicas para S. exigua es reducido estos resultados sugieren que aunque no se han descrito muchas proteínas Cry activas contra esta plaga, el empleo de proteínas descritas como marginalmente tóxicas (Cry1As) podría ser eficaz cuando se emplean en combinación con esporas. El fenómeno de aparición de resistencia a insecticidas es uno de los problemas más graves en el control de plagas agrícolas. El desarrollo de la resistencia se debe en gran medida a la enorme variabilidad genética que poseen los insectos, haciendo posible que aparezcan individuos que sean tolerantes o incluso resistentes tanto a insecticidas biológicos como químicos. Actualmente, tan sólo se han descrito dos casos de resistencia a formulados de B. thuringiensis. Para mantener la eficacia de los productos basados en B. thuringiensis es necesario conocer los mecanismos que desencadenan resistencia para poder diseñar una buena estrategia de control. Dado que los estudios de selección realizados en el laboratorio han ayudado a conocer con mayor profundidad las bases genéticas de la resistencia nos planteamos seleccionar una colonia de S. exigua en el laboratorio. Los resultados obtenidos en el presente trabajo muestran la capacidad para desarrollar resistencia en una colonia de S. exigua, tanto al agente de selección (RR > 29 en 19 generaciones) como a otras proteínas, Cry1Ca, Cry1Da y Cry1Fa (>20, 26 y >8, respectivamente) (resistencia cruzada). El aumento de la actividad de las proteasas intestinales como posible mecanismo de resistencia fue analizado aunque no se observaron diferencias entre la actividad para la colonia seleccionada y la colonia control. Finalmente, empleamos la tecnología de las macromatrices para analizar en primer lugar las diferencias de expresión entre una colonia susceptible y otra resistente y además analizar los cambios en el patrón transcripcional para estas colonias tras la exposición a un producto comercial de B. thuringiensis. Los resultados obtenidos tras comparar los patrones de expresión entre una colonia susceptible y otra resistente sugieren que los genes candidatos de resistencia (caderina y apn) no estarían involucrados en el desarrollo de la resistencia. La variación a nivel de expresión de genes relacionados en respuesta apuntan a que este tipo de variaciones podrían actuar como un sistema de defensa contra patógenos. Además, la observación de la disminución de los niveles de expresión de algunos de estos genes relacionados con respuesta (repat) en la colonia Xen-RU junto con la pérdida de resistencia para esta colonia, apoyan la posible función de estos genes en adquisición de resistencia. El número de genes con un patrón de expresión diferencial observados tras comparar la colonia resistente Xen-R control con la expuesta fue menor que el obtenido para la colonia FRA. Los genes que modificaron su patrón se relacionaron con funciones de respuesta y/o defensa (repat, inhibidores de serín proteasas). Una respuesta inmune pre-activada podría explicar el menor número de variaciones observadas en el patrón de expresión de la colonia Xen-R tras la exposición al producto comercial Xentari®. Sugiriendo que la colonia resistente podría tener un mecanismo de tolerancia basado en una elevada respuesta del sistema inmune o de defensa, por lo que tras una nueva exposición los cambios que se producen fueran menores.