Bases moleculares del control del modo de reproducción en pulgones. Identificación de genes regulados por el fotoperiodo y caracterización de los elementos del reloj circadiano en acyrthosiphon pisum

Résumé

Los pulgones son un grupo de insectos que se alimentan de la savia de las plantas y que forman la familia Aphididae, dentro del orden Hemiptera. Su ciclo de vida se caracteriza por la partenogénesis cíclica, consistente en la sucesión de varias generaciones de hembras partenogenéticas vivíparas (en las estaciones favorables) seguidas de una única generación de individuos sexuados, que da origen a un huevo diapáusico capaz de resistir la estación desfavorable. La duración del fotoperiodo es el factor clave involucrado en este polifenismo reproductivo, convirtiendo a los pulgones en animales fotoperiódicos por excelencia. El conocimiento de las bases moleculares que controlan la estacionalidad en los pulgones es muy limitado y, hasta el momento, son muy pocos los genes candidatos a participar en este proceso. Diversos estudios establecen un vínculo entre la maquinaria del reloj circadiano y el fotoperiodismo en insectos. Recientemente, el Consorcio Internacional para la Genómica del Pulgón (IAGC) ha elegido al pulgón modelo Acyrthosiphon pisum para el desarrollo de herramientas genómicas que han culminado en la reciente secuenciación, anotación y publicación del genoma de A. pisum. En el primer capítulo de esta tesis se ha llevado a cabo un análisis transcriptómico de la respuesta al fotoperiodo, consistente en la búsqueda "a ciegas" de genes mediante la realización de genotecas substractivas de cDNA derivadas de pulgones mantenidos en dos condiciones de fotoperiodo diferentes (uno inductor y otro represor de la reproducción sexual). Se han identificado un total de 551 secuencias del pulgón A. pisum correspondientes a genes probablemente regulados por el fotoperiodo. De ellas, 316 corresponderían potencialmente a genes con sobreexpresión bajo condiciones de fotoperiodo corto, y 235 a genes reprimidos en esas mismas condiciones (sobreexpresados bajo fotoperiodo largo). El 74% de las secuencias identificadas en nuestras genotecas ha mostrado similitud significativa con genes descritos en las bases de datos públicas de secuencias. Hemos podido comprobar la expresión diferencial en función del fotoperiodo, mediante PCR cuantitativa en tiempo real, para 17 (60,7%) de un total de 28 genes seleccionados. De entre los genes con expresión diferencial dependiente del fotoperiodo identificados, cabe destacar la presencia de 3 genes que codifican proteínas de cutícula y que sugieren que la inducción de las formas sexuales podría implicar una modificación de las propiedades de la cutícula de las generaciones de pulgones sometidas a condiciones de fotoperiodo corto. También cabe destacar la identificación de dos genes de función desconocida, designados como No-hit 1 y No-hit 2, con expresión diferencial en condiciones de fotoperiodo corto, y para los que se ha llevado a cabo la caracterización molecular completa de su secuencia genómica y de cDNA. Esta caracterización molecular ha permitido poner de manifiesto la existencia de polimorfismos en ambos genes que merecen ser investigados en mayor detalle para comprobar su posible relación con las variaciones en la respuesta fotoperiódica. En el segundo capítulo de esta tesis se ha investigado la presencia de los genes centrales del reloj circadiano conocidos en Drosophila en el pulgón Acyrthosiphon pisum, a fin de comprobar si existe un reloj circadiano funcional y si éste podría participar en el control de la estacionalidad en los pulgones. El genoma de A. pisum contiene genes ortólogos de todos los genes que constituyen el core del reloj circadiano de Drosophila, así como de otros genes involucrados en la estabilidad y degradación de los productos de los genes core, a excepción del gen jetlag. Asimismo, el genoma de A. pisum también presenta un ortólogo del criptocromo tipo mamífero o cry2, confirmando su presencia en insectos hemimetábolos y la excepcionalidad de su ausencia en los drosofílidos. Además, de forma similar a como ocurre en vertebrados, existen dos copias de este gen en el genoma de A. pisum. Por otra parte, los test de tasas relativas y de composición aminoacídica realizados han revelado una evolución acelerada de los genes integrantes del bucle per de retroalimentación negativa (apPer, apTim, apClk, apCyc y apCry2) en relación a sus ortólogos en otros insectos. El análisis de los patrones temporales de expresión de los genes centrales del reloj, bajo dos condiciones de fotoperiodo diferentes, ha revelado patrones rítmicos de expresión para los genes apPer, apCyc y apCry2, sugiriendo la existencia de un reloj circadiano funcional en el pulgón, similar al modelo de reloj ancestral propuesto para insectos. Por último, la mayor amplitud observada para los genes apPer y apCry2 en las oscilaciones de los niveles de expresión en condiciones de fotoperiodo corto en relación a las observadas en condiciones de fotoperiodo largo, sugieren la existencia de un vínculo entre el control del ritmo circadiano y los procesos dependientes del fotoperiodo en pulgones.