Hepatocitos adultos y células progenitoras mesenquimales para terapia celular hepáticaaislamiento, caracterización y mecanismos que determinan un fenotipo hepático diferenciado

Resumen

El trasplante de órgano ha sido uno de los grandes logros médicos del siglo XX, sin embargo, actualmente existe un gran desfase entre el número de pacientes que podrían beneficiarse del trasplante hepático y la actual disponibilidad de órganos. Es necesario, por tanto, la búsqueda de alternativas al trasplante hepático de órgano entero como tratamiento de las enfermedades hepáticas crónicas o terminales, y especialmente de las enfermedades hepáticas congénitas. La posibilidad de aplicar estrategias similares a las que de forma natural usa el organismo para la renovación de las células en un tejido dañado, es la idea central que subyace tras el concepto terapia celular. Basándonos en la estrategia de aplicación, podemos considerar que existen dos posibles vías de actuación en terapia celular hepática: a) trasplante de células somáticas diferenciadas (hepatocitos adultos) y b) trasplante de células progenitoras capaces de dar origen a hepatocitos funcionales en el propio órgano dañado, o células progenitoras susceptibles de ser diferenciadas a fenotipo hepático in vitro. Los objetivos concretos de la presente tesis doctoral han sido: 1) optimizar el proceso de aislamiento de hepatocitos a partir de órganos enteros descartados para implante y establecer los criterios de exclusión de tejido hepático para trasplante celular, 2) establecer un protocolo de criopreservación y caracterización funcional de los hepatocitos para adaptarlos a las necesidades del paciente, 3) optimizar las condiciones para llevar a cabo la infusión celular, 4) determinar la fuente de células madre mesenquimales adultas (de médula ósea, BMSC, y tejido adiposo, ADSC) con mayor potencial de transdiferenciación hepática e idoneidad para terapia celular hepática autóloga y 5) explorar los mediadores solubles más eficientes, los marcadores y los posibles mecanismos que subyacen a la reprogramación celular de ADSC hacia células de fenotipo hepático. Los resultados experimentales obtenidos demuestran que el aislamiento de hepatocitos a partir de órganos enteros descartados para implante es posible, obteniendo viabilidades y rendimientos celulares satisfactorios. Los hígados procedentes de donantes en asistolia, así como de neonatos, son aptos para aislamiento de hepatocitos viables y funcionales; mientras que la calidad de los hepatocitos obtenidos de hígados esteatósicos (esteatosis >40%) o tras periodos prolongados de isquemia fría (>14 horas), desciende drásticamente, inutilizándolos para trasplante celular hepático (TCH). La criopreservación de los preparados celulares disminuye sensiblemente la viabilidad celular y eficiencia de adhesión, sin embargo las células criopreservadas mantienen su competencia metabólica y sus funciones específicas (potencial ureogénico y actividad UGT1A1). Esto las hace aptas para TCH y permite hacer un uso programado y personalizado de los preparados celulares atendiendo a la patología del receptor (desórdenes en el ciclo de la urea y Síndrome de Crigler-Najjar, patologías de mayor incidencia en niños) .Las condiciones del medio de infusión afectan directamente a la calidad de los hepatocitos; obteniendo una mejor preservación de la viabilidad y funcionalidad, en condiciones de hipotermia extrema (4ºC) y en presencia de glucosa y NAC. Sin embargo el citrato o la heparina como anticoagulantes no producen diferencias significativas. Desde que se inició el programa de TCH en el Hospital La Fe se han realizado 7 trasplantes, 3 de ellos en pacientes adultos y 4 en pacientes pediátricos, mejorando la calidad de vida y evolución clínica, o actuando de puente hasta la llegada de un órgano. A pesar de haberse explorado nuevas fuentes de hepatocitos, sigue existiendo una falta de células funcionales. Los resultados obtenidos demuestran que las ADSC presentan un potencial de diferenciación hepático similar a las BMSC. Aunque es posible la transdiferenciación in vitro de ambas poblaciones celulares hacia fenotipo hepático, las ADSC ofrecen ciertas ventajas para una futura aplicación terapéutica. FGFb, FGF-4, EGF, y HGF participan activamente en la inducción de la diferenciación hepática temprana de ADSC, mientras que OSM, Dex e ITS promueven la maduración hepática. Las BMPs, por el contrario, no median la reprogramación hepática de ADSC. En la fase de diferenciación temprana de ADSC se inducen los factores Hex, GATA6, C/EBPs y PGC1alfa y se expresan los marcadores alfa2M, C3 y SEPP1, mientras que en la fase de maduración se activa HNF4alfa se inducen los marcadores ACSL1, AGTR1, APOE y CYP3A4, y se adquieren funciones típicas hepáticas. Además, la ganancia de fenotipo hepático y por consiguiente la pérdida de fenotipo mesenquimal, puede ser inducida también mediante la activación transcripcional de genes típicamente hepáticos por medio de la transducción con vectores adenovirales que codifican para factores de transcripción clave: C/EBPbeta y HNF4alfa.