Caracterización de los cambios en el inmuno-fenotipo asociados a la aparición de la encefalopatía hepática mínima en pacientes cirróticos

Resumen

Resumen dela tesis doctoral Alba Mangas Losada Introducción: Los pacientes con cirrosis hepática presentan frecuentemente encefalopatía hepática mínima (EHM) con déficits cognitivos, de atención y coordinación motora que disminuyen su calidad de vida y aumentan el riesgo de accidentes. No se conocen los mecanismos que conducen a estas alteraciones ni se dispone de tratamientos para mejorarlas. Se sabe, por estudios anteriores, que los pacientes con EHM tienen un estado de inflamación mayor que es el que lleva, junto con una mala detoxificación del amonio, a provocar los déficits cognitivos. Esta tesis, por tanto, se centra en el estudio del sistema inmune y la inflamación de los pacientes cirróticos con EHM y los cambios específicos en el inmunofenotipo asociados a la aparición de la EHM. Proponemos la hipótesis de que la aparición de la EHM se asociaría a algún cambio cualitativo específico en la inflamación periférica. El objetivo de este trabajo fue caracterizar los cambios en la inflamación periférica asociados a la EHM. Se analizaron por inmunofenotipificación y análisis de perfil de citocinas, en pacientes cirróticos sin o con EHM y controles sin enfermedad hepática los siguientes parámetros: a) subgrupos de monocitos: clásicos (CD14 ++ CD16-), intermedios (CD14 ++ CD16 +) y no clásicos (CD14 + CD16 ++); B) el subconjunto celular CD4 + CD28- pro-inflamatorio y los linfocitos T naive y de memoria ; C) activación de linfocitos T y B midiendo los niveles de marcador de activación temprana CD69 e IgG; D) diferenciación de linfocitos T CD4 + a diferentes subtipos: Th1, Th2, Th17, Th22, iTreg o Tfh y e) perfil de citocinas séricas: IL-6, IL-10, TNFα, CCL20, CXCL13, IL-15, CX3CR1 , TGFbeta, IL - 21, IL - 17, IL - 12, IL - 18, IL - 1beta e IL - 22. Metodología: Pacientes y controles. Los estudios se realizarán en controles sanos, en pacientes cirróticos sin EHM y en pacientes cirróticos con EHM diagnosticada utilizando la batería PHES de tests psicométricos. Se incluirán en el estudio pacientes que no hayan tenido EH clínica y se encuentren compensados, bien tras un episodio de descompensación por ascitis o hemorragia digestiva o por encontrarse en fase B de Child-Pugh. Se aplicará como criterio de exclusión que el paciente presente alguna otra enfermedad neurológica, psíquica, descompensación diabética, alcoholismo o adicción activa a las drogas. El procedimiento a seguir en cada individuo será el siguiente: 1) Información y recogida del consentimiento informado (Declaración de Helsinki) 2) Recogida de datos epidemiológicos y de la enfermedad hepática: etiología 3) Recogida de valores analíticos 4) Determinación de la presencia de EHM. Se determinará mediante la batería de tests psicométricos Psychometric Hepatic Encephalopathy Score (PHES). Se considerará que un individuo presenta EHM si su puntuación es -4 ó inferior. (Weissenborn et al., 2001; Ferenci et al., 2002). 5) Evaluación de atención selectiva y sostenida y de coordinación motora: Los sujetos realizarán los siguientes tests: Test Stroop, test de atención “d2” y test de coordinación bimanual y visomotora. 6) Evaluación de la inflamación y de parámetros relacionados con el sistema inmunológico en sangre. Posible identificación de biomarcadores periféricos para diagnosticar la presencia de EHM y de alteraciones neuropsicológicas específicas en pacientes cirróticos. Relación entre el sistema periférico y el deterioro cognitivo visto en pacientes con EHM. Resultados obtenidos: Las principales alteraciones asociadas específicamente con EHM, no presentes en los pacientes sin MHE, son: 1) aumento de la activación de todos los subtipos de linfocitos T CD4 +, como se indica por el aumento de la expresión de CD69; 2) una mayor cantidad de linfocitos CD4 + CD28-T, asociados con niveles aumentados de CX3CL1 (fractalkina) y de IL-15; 3) aumento de la diferenciación de linfocitos T CD4 + a Th folicular y Th22; 4) aumento de la activación de linfocitos B y IgG sérica. Conclusión: Este estudio ha identificado algunas alteraciones del sistema inmune que están asociadas específicamente con la aparición de las alteraciones neurológicas en pacientes cirróticos con EMH. Discusión: La encefalopatía hepática (EH) es una consecuencia del fallo hepático y conlleva un amplio rango de alteraciones neuropsiquiátricas, desde ligeros cambios en la personalidad o alteraciones en el ciclo sueño-vigilia, hasta alteraciones en la función cognitiva, en la coordinación motora y en el grado de consciencia. Entre el 30 y el 50% de los pacientes con cirrosis que no muestran signos clínicos de EH presentan encefalopatía hepática mínima (EHM) con un leve deterioro cognitivo. Los pacientes con EHM pueden presentar diversos déficits cognitivos (percepción visuoespacial, atención, concentración) y motores (enlentecimiento psicomotor) que no son detectables en un examen neurológico rutinario pero se ponen de manifiesto cuando se realizan test psicométricos específicos (Amodio et al., 2004). Los pacientes cirróticos presentan hiperamonemia, que alcanza niveles similares en los grupos sin y con EHM. El amonio es capaz de atravesar la barrera hematoencefalica (BHE) induciendo alteraciones en el sistema nervioso central. Se ha demostrado que la hiperamonemia crónica altera la vía del GMPc en cerebro y que este es responsable de algunos tipos de deterioro cognitivo (Felipo, 2013). La inflamación agrava las alteraciones neurológicas producidas por la hiperamonemia en pacientes cirróticos y que además, determina el grado de severidad de la EH en pacientes cirróticos con EH avanzada (Shawcross et al., 2004). En esta tesis se ha realizado un amplio estudio de citocinas en pacientes cirróticos, demostrando que los niveles de IL-6, IL-21, IL-17, IL-10, IFNγ, IL-18, CCL20, TNFα, CXCL13, IL-15 y CX3CL1 en suero están aumentados tanto en los cirróticos con o sin EHM, pero los pacientes con EHM muestran un aumento mayor que los pacientes sin EHM, sugiriendo una respuesta inmunológica más potente en los pacientes con EHM. En el caso del TGFβ, los pacientes cirróticos muestran una disminución en suero independiente de la presencia de EHM. Además, los niveles de IL-12, IL-1β e IL-22 muestran un incremento exclusivo de los pacientes con EHM, que no vemos en paciente sin EHM, sugiriendo que el aumento de estas interleucinas se produce en estadios más tardíos del desarrollo de la EHM. Además, la IL-6, IL-21, TGFβ, IL-10, IL-18, IL-13, CCL20, TNFα, CXCL13, IL-15 y CX3CL1 correlacionan significativamente con el grado de EHM (según puntuación del PHES), indicando que la inflamación es un contribuyente esencial al deterioro neurológico en la EHM. Todos estos datos concluyen claramente que la inflamación tiene un papel fundamental en el desarrollo del deterioro neurológico, cognitivo y motor, en los pacientes cirróticos que presentan EHM. El hecho de que la inflamación esté relacionada con más alteraciones neurológicas que la hiperamonemia, indica que sería el grado de inflamación el que tendría más peso en la determinación de la aparición del deterioro neurológico. En cuanto al estudio del inmunofenotipo, observamos una serie de cambios en los pacientes con EHM. En primer lugar, atendemos a los monocitos representados por los marcadores de superficie CD14 y CD16, con mayor o menos expresión en función de si son clásicos, intermedios o no clásicos. Hay una disminución de la población clásica (CD14++CD16-) y un aumento de la población intermedia (CD14++CD16+) en los pacientes con EHM. Esto va a provocar, por una parte, que haya mayor producción de citocinas proinflamatorias por parte de los monocitos/macrófagos intermedios que va a propiciar un ambiente proinflamatorio que condicionará la diferenciación de los diferentes subtipos de linfocitos CD4. Por otra parte, estos mismos macrófagos M1 van a actuar como CPA con los linfocitos, de manera que pueden activar a los linfocitos naive. Observamos un aumento de los linfocitos autoreactivos CD4+CD28- en los pacientes con EHM. Esta población celular va a ser atraída hacia gradientes de CX3CL1 ayudados por la IL-15 (vemos que ambas citocinas están aumentadas en EHM). El CX3CL1 puede ser producido en células endoteliales y las IL-15 en células de tejido nervioso, entre otras. Proponemos la primera hipótesis de infiltración de CD4+CD28- a través de la BHE, promovida por el aumento de CX3CL1 e IL-15 en el medio. Vemos un cambio de los linfocitos naive hacia los de memoria en ambos tipos de pacientes. Por el contrario, observamos un mayor número de células positivas para el marcador de activación CD69, exclusivo en pacientes con EHM, en varios tipos celulares, como los linfocitos CD4, tanto CD28+ como CD28-, en los CD4 naive, en los CD4 de memoria y en los linfocitos B. A partir del aumento de ciertas citocinas proinflamatorias en suero de pacientes con EHM, como el TNFα, la IL-6 y la IL-1β, que tienen sus receptores en células endoteliales, proponemos nuestra segunda hipótesis, la transmisión de señales a través de los receptores de interleucinas en células endoteliales. Tras desencadenar la cascada de trasmisión de señales, causarían un efecto directo sobre las células neurales al otro lado de las BHE. Los linfocitos CD4 naive se diferencian en varias subpoblaciones en función de ciertos factores que condicionan el medio. Las dos subpoblaciones principales aumentadas en pacientes con EHM son los Th22 y los Tfh, corroborado también con el aumento de las citocinas que producen. La IL-21 favorece a la diferenciación de los Th17 e inhibe las iTreg, pero su principal función es la activación de los linfocitos B. Por ello, vemos una mayor producción de IgG en los pacientes con EHM y la posible formación de centros germinales. Además, la IL-22, la IL-17 y la IL-21 favorecen la secreción de CXCL13, desde estos centros germinales, cuya función es atraer a los linfocitos B y los Thf hacia los mismos. A partir de estos datos establecemos nuestras dos últimas hipótesis, la infiltración de Tfh y la posible formación de órganos linfoides terciarios dentro del cerebro de pacientes con EHM, que estaría propiciada por los propios Tfh infiltrados. A partir de aquí, sería necesaria la continuidad de estos estudios para caracterizar mejor la contribución de los cambios inmunológicos en las alteraciones neurológicas y su posible utilidad en el diagnóstico temprano de la EHM en pacientes cirróticos.