Estudio de la regulación epigenética de la vía wnt por metilación aberrante de sus genes represores en la leucemia mieloide aguda

Zusammenfassung

INTRODUCCIÓN La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad clonal resultante de la transformación maligna de precursores hematopoyéticos. Se caracteriza por la presencia de un stop madurativo de las células de la línea mieloide lo que supone una hematopoyesis incompleta. Durante las últimas décadas se ha llevado a cabo un progreso considerable en la elucidación de la patogénesis molecular de la enfermedad. La mayoría de eventos genéticos implicados en el desarrollo de la LMA comprenden alteraciones de los factores de transcripción mieloides y mutaciones activadoras de los intermediarios de transducción de señales lo que desencadena una expresión génica inapropiada y una transducción de señales aberrante, respectivamente. Ambos mecanismos son altamente independientes, resultando en apoptosis reducida, incremento de la auto-renovación de las células madres y un bloqueo en la diferenciación de las células leucémicas [1]. Se supone que la LMA proviene de una transformación maligna de una célula madre hematopoyética (CMH) normal a una célula madre cancerígena. Las CMH y las células embrionarias poseen la propiedad única de la autorregeneración y la habilidad de desarrollar diferentes linajes celulares más diferenciados [2]. Por lo tanto, las CMH son consideradas unas buenas candidatas para la acumulación de mutaciones genéticas que provocarían su transformación en células madres leucémicas [3 y 4]. El estudio de la biología de las células madre adultas ha permitido demostrar que las vías de señalización que regulan estos procesos son muy reducidas, y entre ellas se encuentra la vía Wnt. La vía Wnt es una cascada de señales que regula el destino celular de las células embrionarias durante la embriogénesis y de las células madre adultas para el desarrollo de órganos y tejidos [5]. En los últimos años, se ha observado que en muchos tejidos donde la vía Wnt controla el crecimiento de las células madre, aparecen tumores cuando la vía se encuentra desregulada [6, 7 y 8]. Concretamente, interviene en la auto-renovación y proliferación de las CMHs, lo que sugiere que podría tener también una implicación en leucemogénesis [9 y 10]. La vía Wnt canónica La vía Wnt está altamente conservada a lo largo de la evolución en todo el reino animal y juega un papel importante en la decisión del destino celular y desarrollo de tejidos. En el centro de esta vía se encuentra un complejo multiproteico de destrucción formado por el producto de los genes supresores de tumores APC y axina, además de las cinasas GSK3ß y CK1. La proteína mediadora de la vía es la ß-catenina, cuyos niveles se mantiene bajos gracias a la fosforilación que sufre por parte de GSK3ß, que la lleva a la ubiquitinación y finalmente degradación. La unión de los ligandos Wnt se encargan de la activación de la vía a través de la unión a sus receptores de membrana Frizzled (Fz) y las lipoproteínas de baja densidad LRP5 ó 6, lo cual desemboca en la desestabilización del complejo de destrucción, reduciéndose la fosforilación y posterior degradación de la ß-catenina, por lo que podrá entrar en el núcleo donde se une a los factores de transcripción T-cell factor (Tcf)/lymphoid-enhancing factor (Lef) para inducir la expresión de los genes diana de la vía como son la ciclina D1 y c-Myc, implicados en proliferación celular [11]. La vía Wnt está regulada en diferentes niveles de la cascada para su apropiada inactivación por proteínas extracelulares antagonistas Wnt que interfieren con la unión de los ligandos Wnt a sus receptores de membrana y suponen la inactivación de la vía. Por ejemplo, los 4 genes homólogos Dickkopf 1-4 (DKK), son reguladores negativos de la vía Wnt, ya que al interaccionar con las proteínas LRP5/6 inhiben el desencadenamiento de la cascada. Además, existen otros inhibidores que tienen afinidad por las proteínas Wnt que se encuentran en solución, impidiendo su acceso a la membrana para la activación de la vía. Entre ellos se encuentran, la familia de proteínas relacionadas con Frizzled (sFRP), que son formas secretadas por las proteínas Frizzled de membrana pero que no disponen de dominio transmembrana por lo que quedan libre en el exterior de la célula y, por otro lado, el factor de inhibición Wnt 1 (Wif-1). Implicación de la vía Wnt en la LMA La desregulación de la vía Wnt ha sido identificada como un factor clave en el inicio de varios tipos de tumores. La activación constitutiva de la vía Wnt frecuentemente es debida a la existencia de mutaciones en el gen ß-catenina, u otros miembros de la vía. Por ejemplo, el gen APC está frecuentemente mutado en cáncer de colon [12] y la axina en carcinomas hepatocelulares [13]. El hecho de que la vía Wnt intervenga en la supervivencia, proliferación y diferenciación de las CMH sugiere que la desregulación de la vía podría contribuir en la patogénesis de la LMA. Además varios genes diana de la vía son conocidos oncogenes, por ejemplo c-Myc y ciclina D1, que podrían estar implicados en la función oncogénica de una activación inapropiada de Wnt. La LMA está frecuentemente asociada con mutaciones del receptor tirosin-cinasa FLT3 y con translocaciones, tales como t(15;17) y t(8;21). Recientemente se ha publicado la asociación de estas alteraciones con una activación aberrante de la vía Wnt. Se ha observado la regulación activadora que ejerce FLT3 sobre las proteínas Fz de membrana y de las proteínas de fusión AML1-ETO, PML-RAR¿ y PLZF-RAR¿ sobre la plakoglobina (¿-catenina), una proteína intermediaria análoga de la ß-catenina, que también actúa como co-activador de los factores de transcripción Tcf/Lef [14 y 15]. Sin embargo se ha visto que pacientes que no muestran ninguna de estas alteraciones comunes en la LMA, también muestran activación aberrante de la vía, lo que sugiere que existen otros mecanismos de activación inapropiada de la vía independientes de estas alteraciones. En la leucemia aguda, la hipermetilación aberrante del promotor de genes implicados en el control del ciclo celular y cascadas de señales es muy frecuente [16]. Se ha demostrado que la metilación de los genes antagonistas de Wnt es un evento que ocurre en algunas neoplasias hematológicas. Román et al. estudió las islas CpG del promotor del gen DKK3 en 183 pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) observando que la metilación del gen se asociaba a una supervivencia global (SG) y supervivencia libre de enfermedad (SLE) menor que en los pacientes que no presentaban metilado este gen (p=0.09 y 0.001, respectivamente). Además en el análisis multivariante para la SLE, la metilación resultó ser un factor pronóstico independiente [17]. Más adelante se demostró la metilación de los genes sFRP en leucemia linfocítica crónica-B (LLC-B), observando que todos excepto sFRP5 se encontraban densamente metilados y por lo tanto su expresión se reducía, por lo que el silenciamiento de estos genes por metilación podría contribuir a la activación aberrante de la vía Wnt en la LLC [18]. En el año 2006 Chim et al. realizaron en pacientes diagnosticados de LMA, LLA y leucemia promielocítica aguda (LPA) un estudio de la hipermetilación del gen Wif-1 observando que este gen no se encontraba metilado en ningún subtipo FAB de la LMA, sin embargo tenía una frecuencia de metilación del 20% de las LLA y 47% en la LPA. Además, en el grupo de las LPA la metilación de Wif1 resultó ser un factor pronóstico independiente para la SLE tras 3 años de seguimiento [19]. Paralelamente, Suzuki et al. demostraron en 47 LMA que el gen DKK1 se encuentra metilado con una frecuencia del 30%, especialmente en las leucemias CBF [20]. Una vez más, Román et al. comprobaron en líneas celulares in vitro y en una serie de 261 LLA, que en el grupo de pacientes con peor pronóstico la vía aparecía constantemente activada por la inactivación de los genes antagonistas Wnt: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, Wif1, Dkk3 y Hdpr-1, debida a hipermetilación aberrante. Además comprobó que en aquellos pacientes que presentaban algunos de estos genes metilados, los genes activadores de la vía se sobreexpresaban al mantenerse la vía activada constitutivamente [21]. A su vez, Chim et al, publicó que estos mismos genes junto al gen supresor de tumores APC (incluido en el complejo destructor de la vía) se encontraban también metilados en mieloma [22]. Sin embargo, hasta la fecha se han realizado pocos estudios sobre la metilación aberrante de estos genes y su papel pronóstico en la LMA. HIPÓTESIS La vía Wnt es una cascada de transducción de señales altamente conservada durante la evolución que gobierna las decisiones del destino celular durante la embriogénesis y en las células madre adultas, por lo que tiene una gran influencia en la diferenciación de las células madres hematopoyéticas para el desarrollo de una hematopoyesis normal. Sin embargo, la vía Wnt se encuentra activada de forma inapropiada en muchos tipos de cáncer. Esta desregulación ocurre por la alteración de los componentes de la vía Wnt o sus genes antagonistas. En la LMA se ha demostrado que esta vía se encuentra activada por mecanismos tales como la regulación activadora de los componentes intermediarios de la vía por parte de las mutaciones de FLT3 y proteínas de fusión características de los diferentes subtipos FAB de la LMA. Sin embargo, existe otro mecanismo más indirecto de regulación, debido a la metilación de los promotores de los genes inhibidores de la vía Wnt, lo que provoca su inactivación y pérdida de función. Además, en la LMA es un evento frecuente la hipermetilación y represión transcripcional de genes supresores de tumores implicados en el ciclo celular y rutas de señalización que juegan un papel en la progresión de células tumorales creando un impacto en la evolución clínica de la enfermedad. Por ello nos proponemos investigar si la metilación de algunos de los genes antagonistas es responsable en parte de la activación de la vía Wnt y tiene significado pronóstico en la LMA. OBJETIVOS 1 .Caracterización de los casos incluidos mediante una combinación apropiada de citomofología, citometría de flujo, citogenética convencional, y detección de los reordenamientos específicos de cada subtipo de LMA, además de las mutaciones FLT3-ITD y NPM, mediante técnicas de biología molecular. 2. Determinar si los genes inhibidores de la vía Wnt: sFRP1, sFR21, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3, se inactivan por metilación en la LMA en las líneas celulares de LMA: Kasumi 1, KG1a, TPH1 y HL60, y en una serie de 184 pacientes diagnosticados de LMA de novo uniformemente tratados. 3. Evaluar si la metilación de los inhibidores de la vía Wnt, supone una activación de la vía, mediante el estudio de la expresión de los genes activadores de la vía (Tcf y Lef) y el gen diana ciclina D1. 4. Significado pronóstico: relación de cada uno de los marcadores moleculares objeto de estudio, aisladamente o combinados (perfil de marcadores) con los marcadores moleculares/citogenéticos ya conocidos, así como con: a) Características demográficas de los pacientes (edad, sexo) y clínico-biológicas de la LMA (subtipo FAB, leucocitos, grupos de riesgo citogenético, etc.). b) Respuesta al tratamiento antileucémico. c) Relación con los acontecimientos evolutivos (recaída o muerte). BIBLIOGRAFÍA [1] Steffen B, Müller-Tidow C, Schwäble J, Berdel WE, Serve H. The molecular pathogenesis of acute myeloid leukemia. Crit Rev Oncol Hematol. 2005 Nov;56(2):195-221. [2] Jordan CT, Guzman ML, Noble M. Cancer stem cells. N Engl J Med. 2006; 355: 1253-1261. [3] Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 1997 Jul;3(7):730-7. [4] Huntly BJ, Gilliland DG. 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