Nuevos inhibidores de las fosfatasas de tipo pp1 de levadura y mamífero

Resumen

La fosforilación reversible de proteínas es un proceso en el que están involucradas quinasas y fosfatasas constituyendo uno de los mecanismos post-traduccionales más importantes en la regulación de vías intracelulares de señalización. A pesar de que la regulación de quinasas ha sido objeto de estudio durante las últimas décadas, el estudio de las fosfatasas es muy reciente. La fosfatasa de proteínas de tipo 1 (PP1) es una ser/thr fosfatasa, de expresión ubicua, que regula una gran variedad de procesos celulares. La subunidad catalítica de PP1 (PP1c) está altamente conservada en la escala evolutiva, desde hongos hasta mamíferos. En la levadura Sacharomyces cerevisiae sólo hay una PP1c, llamada Glc7, la cual es esencial para la viabilidad celular. De modo similar a su ortólogo en mamíferos, Glc7 participa en la regulación de muchos procesos fisiológicos tales como el metabolismo de glucógeno, la represión por glucosa, la homeostasis de iones, la progresión del ciclo celular, etc. Esta versatilidad funcional de PP1c se debe a la existencia de subunidades reguladoras que pueden llevar a PP1c hacia diferentes compartimentos celulares y/o sustratos y conferirle especificidad de sustrato o modular la actividad enzimática. La actividad de PP1c es esencial pero debe estar altamente controlada ya que su sobreexpresión o hiperactivación puede ser deletérea para la célula. Por lo tanto, un gran número de inhibidores fisiológicos de PP1c han sido identificados en eucariotas superiores. En nuestro laboratorio se identificó la primera subunidad inhibidora de Glc7 en levadura, que llamamos Ypi1 (Yeast Phosphatase Inhibitor 1). Esta proteína contiene el motivo consenso de unión a PP1c y es esencial, lo que sugiere un papel relevante en la fisiología de la levadura. Por otro lado, la sobreexpresión de Ypi1 provoca fenotipos consistentes con un papel inhibidor sobre Glc7. Ypi1 interacciona físicamente (metodo de co-inmunoprecipitación por afinidad) con Sds22. Esta es una proteína esencial de 40 kDa que es capaz de interaccionar con Glc7 y llevarla a sustratos involucrados en mitosis. Sds22 es aparentemente una proteína nuclear, a pesar de no presentar secuencia de localización nuclear (NLS). Ypi1 y Sds22 se originaron antes de la divergencia de las cuatro supertaxa que constituyen la corona eucariótica y constituyen las proteínas reguladoras más antiguas de PP1. El hecho de que Ypi1 y Sds22 se hayan conservado a lo largo de la evolución sugiere que estas proteínas cumplen una función esencial en uno o varios procesos celulares. A lo largo de esta tesis demostramos que Ypi1 y Sds22 forman un complejo heterotrimérico, específico, con Glc7, que se ha conservado a lo largo de la escala evolutiva y que, tanto Ypi1 como Sds22, pueden inhibir la actividad de la fosfatasa Glc7 in vitro. Profundizando en el estudio de las regiones involucradas en la interacción entre Ypi1, Sds22 y Glc7, encontramos que el domino C-terminal de Ypi1 es responsable de la interacción con Sds22, mientras que Glc7 se une al dominio N-terminal de Ypi1, que contiene el motivo de unión a PP1, (R/K)(V/I)X(F/W). También comprobamos que la unión de Sds22 a Ypi1 puede ser independiente de la presencia de Glc7 en el complejo y que la porción N-terminal de Sds22 es innecesaria para la interacción, tanto con Glc7, como con Ypi1. Encontramos que, al igual que Sds22, Ypi1 es una proteína mayoritariamente nuclear. Comprobamos que la ausencia de ambas subunidades reguladoras altera la localización nuclear de Glc7 y lleva a un bloqueo del ciclo celular en metafase. Las funciones de Ypi1 y Sds22 serían necesarias para regular negativamente la actividad catalítica de la fosfatasa para una correcta progresión del ciclo celular. Conociendo que las actividades opuestas de la quinasa Ipl1/Aurora B y la fosfatasa Glc7/PP1 son necesarias para una correcta segregación cromosómica, comprobamos que la sobreexpresión de cualquiera de estas dos proteínas rescata el fenotipo termosensible de un mutante ipl1, lo cual sugeriría que estas dos proteínas estarían restaurando el balance quinasa/fosfatasa dificultando el acceso de Glc7 a sus sustratos. También hemos demostrado que Ypi1 es una fosfoproteína in vivo, que puede defosforilarse, in vitro, en los residuos S99A-S101A-S103A por CK1 y en el residuo S133, por Mck1. Además, la mutación de los residuos fosforilables por CK afecta la capacidad de unión a Glc7 y a Sds22. Otro aspecto importante de esta tesis ha sido la caracterización de los ortólogos de Ypi1 y Sds22 en mamíferos, Inhibidor 3 (I3) y hSds22, respectivamente. Comprobamos que el I3 y hSds22 forman un complejo con PP1 e inhiben su actividad in vitro. Al igual que Ypi1, el I3 es una fosfoproteína, in vivo, que se acumula, mayoritariamente, en el núcleo de las células de mamífero. Sin embargo, el I3 solo complementa la función de ypi1 al co-expresar hSds22, lo cual revela el requerimiento del producto de ambos genes para cumplir la función de Ypi1 en levaduras. Estos datos, observados en conjunto, sugieren que las funciones claves del complejo heterotrimérico I3-hSds22-PP1 están conservadas.