Rna ligasas nucleares y cloroplásticasposible papel en la replicación de los viroides

Resumen

Los viroides están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario que no codifica proteínas. A pesar de su pequeño tamaño, entre 246-401 nt, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y en la mayoría de los casos provocar enfermedades en sus plantas hospedadoras. Los viroides se replican en el núcleo (familia Pospiviroidae) o en el cloroplasto (familia Avsunviroidae) mediante un modelo de círculo rodante que comprende tres etapas: transcripción RNA-RNA, corte y ligación. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de la tercera etapa del ciclo replicativo de estos agentes infecciosos, la circularización de los RNAs monómericos, caracterizando una RNA ligasa nuclear y otra cloroplástica que podrían catalizar la ligación de los miembros de la familia Pospiviroidae y Avsunviroidae, respectivamente. Además, hemos desarrollado un sistema heterólogo basado en la transformación del cloroplasto de Chlamydomonas reinhardti que resulta interesante para estudiar in vivo el ciclo replicativo de los miembros de la familia Avsunviroidae. A partir de cloroplastos íntegros de espinaca, y mediante fraccionamiento de sus proteínas por cromatografía en una columna de heparina, se ha detectado una actividad que cataliza la circularización de los RNAs monoméricos lineales del viroide del manchado solar del aguacate (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) y del viroide latente de la berenjena (Eggplant latent viroid, ELVd) resultantes del autocorte mediado por ribozimas de cabeza de martillo. Sin embargo, no ha podido detectarse en las mismas condiciones la circularización de los otros dos miembros de la familia Avsunviroidae, el viroide del moteado clorótico del crisantemo (Chrysanthemum clorotic mottle viroid, CChMVd) y el viroide del mosaico latente del melocotonero (Peach latent mosaic viroid, PLMVd). Dicha actividad, la primera de esta clase identificada en cloroplastos, reside en una enzima que no requiere ni NTPs ni Mg2+ como cofactores, a diferencia de la mayoría de RNA ligasas conocidas. Experimentos de extensión de cebador indican que el enlace formado por la RNA ligasa cloroplástica no es 3',5'-fosfodiéster como ocurre en las reacciones catalizadas por las RNA ligasas nucleares, sino un enlace atípico que podría ser 2',5'-fosfodiéster como el que generan las 2',5'-RNA ligasas de bacterias y arqueas. La estrategia de RACE circular sobre molde de simple cadena puesta a punto en el presente trabajo ha permitido identificar el mRNA de la tRNA ligasa de tomate a partir de la información proporcionada por etiquetas de secuencias expresadas (expressed sequence tag, EST) de tomate con similitud de secuencia con los mRNAs de las tRNA ligasas de plantas conocidas. El cDNA correspondiente a la tRNA ligasa de tomate identificada fue clonado y expresado en la cepa de Escherichia coli Rosetta 2, que corrige la preferencia codónica y facilita la traducción de proteínas heterólogas de gran tamaño. La expresión en este sistema bacteriano de la tRNA ligasa de tomate y su homóloga de Arabidopsis thaliana condujo a rendimientos desiguales, probablemente debido a que ambas proteínas tienen tiempos de vida media distintos. Ambas enzimas, a diferencia de sus homólogas de trigo y levadura, catalizan la ligación con otros NTPs además de ATP, si bien el resto de propiedades bioquímicas ensayadas son muy similares en todas ellas. Finalmente, se ha transformado el cloroplasto del alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii para expresar heterólogamente RNAs diméricos de ambas polaridades de diversos miembros de la familia Avsunviroidae. Estos RNAs, además de expresarse correctamente en el cloroplasto de dicha alga, son procesados a sus formas lineales y circulares en una proporción similar a la observada en extractos de tejidos infectados con los mismos viroides. Por el contrario, el RNA dimérico del CEVd, un viroide de replicación y localización nuclear, es transcrito pero no procesado. Sin embargo, y a diferencia de lo que ocurre en sus hospedadores naturales, en el cloroplasto de C. reinhardtii no se ha detectado transcripción RNA-RNA, probablemente por la presumible ausencia de la RNA polimerasa cloroplástica dependiente de DNA codificada en el núcleo.