Parasites of diplodus puntazzo in western Mediterraneanmorphological, developmental and host-parasite relationships of monogeneans

Resumen

0.1 Introducción general En España la acuicultura ha experimentado un gran crecimiento durante el pasado siglo, sin embargo, durante los últimos años se ha producido una disminución en la producción de las especies de cultivo más importantes, como la dorada, la lubina y el rodaballo (APROMAR, 2011). Esta situación ha supuesto la primera reducción en la producción de los últimos 25 años. Por este motivo, los productores españoles apuestan por la recuperación de la productividad y el aumento de la competitividad en el mercado y, para poder llevar a cabo estas mejoras, uno de los objetivos marcados es diversificar las especies cultivadas (APROMAR, 2011). En el Mediterráneo español, una de las especies candidatas para ser introducida es el sargo picudo, Diplodus puntazzo (Walbaum 1792). La acuicultura está interesada en esta especie ya que sus características de crecimiento son similares a las de otros espáridos que se cultivan en la actualidad, como la dorada Sparus aurata L., por lo que su introducción en los sistemas de cultivo requiere menor esfuerzo (Franicevic, 1989; Caggiano et al., 1993; Abellán et al., 1994). Como contraste, resulta interesante el hecho de que a pesar de su reciente importancia en la industria acuícola mediterránea, el sargo picudo ha carecido de interés por parte de las pesquerías, ya que su distribución, costera y asociada a fondos rocosos, dificulta su captura (FAO, 2010). El desarrollo de nuevos cultivos es actualmente el objetivo principal de la acuicultura española, pero no hay que olvidar los problemas que lleva asociada la introducción de nuevas especies de peces en los sistemas de producción acuícolas, principalmente por la aparición de organismos patógenos: i) la transmisión de los patógenos endémicos de una nueva especie compromete su propio cultivo y ii) los nuevos patógenos introducidos con la nueva especie ponen en peligro otros cultivos existentes. Por lo tanto, establecer cuáles son los patógenos potenciales de los peces introducidos es necesario para asegurar el éxito de estos cultivos y prevenir poner en riesgo los cultivos ya consolidados. Respondiendo a las necesidades de la acuicultura española, la presente tesis doctoral está basada principalmente en: i) el estudio general de los parásitos del sargo picudo en condiciones tanto de cultivo como salvaje, identificando parásitos que pueden actuar como patógenos potenciales, representado un riesgo para los cultivos y también para las otras especies cultivadas en las mismas instalaciones acuícolas; y ii) el estudio de la morfología, el desarrollo post-larval y las relaciones parásito-hospedador de los parásitos monogeneos del sargo picudo. 0.1.1 Diplodus puntazzo La especie Diplodus puntazzo es un perciforme perteneciente a la familia Sparidae, que presenta una distribución Atlántica Suroriental. Presente en el Atlántico desde la Bahía de Vizcaya hasta Sierra Leona, es muy común en el Mar Mediterráneo, Mar Negro y el estrecho de Gibraltar. Es una especie gregaria que habita aguas costeras, sobre fondos arenosos o rocosos, entre 0 y 150 m de profundidad, pero normalmente se encuentra alrededor de los 50 m. Es omnívora, y se alimenta de algas, gusanos, moluscos y camarones (Froese y Pauly, 2007). Los juveniles tienen líneas verticales alternas claras y oscuras, que desaparecen en los individuos de gran tamaño. En los adultos, sobre el pedúnculo caudal, se observa un anillo oscuro. Sin embargo, la característica más notable es su hocico alargado, mucho más prominente que en el resto de los miembros de su familia. Tienen una o dos filas de pequeños dientes molariformes, que desaparecen en los adultos (Froese y Pauly, 2007). 0.1.2 Conocimientos previos sobre la fauna parasita de D. puntazzo A pesar de la importancia actual del sargo picudo para la acuicultura española, existen pocos estudios referidos a su fauna parásita (Álvarez-Pellitero et al., 2008; Athanassopoulou et al., 1999; Athanassopoulou et al., 2005; Di Cave et al., 2002; Katharios el al., 2006; Merella et al., 2005; Mladineo y Marši¿-Lu¿i¿, 2007; Montero et al., 2007; Toksen, 2006; Vagianou et al., 2004), la mayoría de ellos referidos a condiciones de cultivo. Hasta la fecha un total de 37 especies de parásitos han sido citadas en sargos picudos del Mediterráneo: 5 protozoos, 5 mixozoos, 8 trematodos, 13 monogeneos, 5 copépodos y 1 isópodo. Los monogeneos son el grupo más abundante y, junto a los mixozoos, constituyen los parásitos más importantes en la acuicultura mediterránea debido a las patologías que causan en sus hospedadores. El mixozoo intestinal Enteromyxum leei (Diamant, Lom et Dyková 1994) y el monogeneo Sparicotyle chrysophrii Van Beneden et Hesse 1863 son parásitos realmente patógenos que han causado importantes mortalidades y pérdidas en instalaciones acuícolas, principalmente en especies de espáridos como la dorada y en el sargo picudo (Faisal, 1990; Sanz, 1992; Di Cave, 2003; Athanassopoulou et al., 2005; Katharios et al., 2006; Toksen, 2006; Amine et al., 2007; Montero et al.,, 2007; Álvarez-Pellitero et al., 2008; Davey et al., 2011). 0.1.3 Los Monogeneos En esta tesis se desarrollan diferentes estudios sobre las especies de monogeneos que parasitan el sargo picudo, la dorada y la lubina, correspondientes a la familia Diplectanidae Monticelli 1903; Lamellodiscus theroni Amine, Euzet et Kechemir-Issad 2007 y L. falcus Amine, Euzet et Kechemir-Issad 2006 parásitos del sargo picudo, Furnestinia echeneis (Wagener 1857) Euzet et Audouin 1959 parásito de la dorada y Diplectanum aequans (Wagener 1857) Diesing 1858 parásito de la lubina. Los monogeneos son parásitos externos que habitan en las branquias y la piel de sus hospedadores, habitualmente peces, tanto marinos como de agua dulce (Hayward, 2005; Whittington y Chisholm, 2008). En general, estos parásitos presentan ciclos de vida directos y una elevada especificidad con respecto a sus hospedadores (Hayward, 2005). 0.1.4 El presente estudio El presente estudio se ha llevado a cabo dentro del marco fundamentalmente de tres proyectos, uno de ellos dedicado a las enfermedades del sargo picudo como nuevo candidato para la acuicultura: i) ¿Parásitos patógenos en nuevas especies de la acuicultura Mediterránea: una aproximación experimental¿ (financiado por la Unión Europea) y dos dedicados al estudio de las enfermedades de espáridos de interés comercial: ii) ¿Parásitos patógenos del sargo picudo: transmisión a la dorada y riesgos¿ (financiado por el Gobierno de España) y iii) ¿Red Valenciana de investigación y desarrollo de patologías en acuicultura¿ (financiado por la Generalitat Valenciana). 0.2 Justificación y Objetivos La presente tesis tiene dos propósitos generales: i) aportar nuevos datos sobre la fauna parásita del sargo picudo en el Mediterráneo y aplicar este conocimiento en un posterior análisis de los riesgos que suponen para su cultivo, para asesorar posibles prácticas de prevención en acuicultura; y ii) examinar en detalle algunos de los parásitos monogeneos del sargo picudo y de las dos principales especies de cultivo del Mediterráneo español, la dorada y la lubina, estudiando el anclaje a los hospedadores, las patologías asociadas y su desarrollo. Los objetivos concretos a desarrollar han sido los siguientes: 1 Identificar la fauna parásita del sargo picudo, tanto salvaje como cultivado, en el Mediterráneo español, y determinar qué parásitos pueden comprometer su cultivo. 2 Estudiar los posibles riesgos de los parásitos protozoos y metazoos a los cultivos del sargo picudo en el Mediterráneo español. 3 Comparar el anclaje de tres monogeneos diplectánidos y las patologías que causan mediante análisis morfológicos e histológicos de los parásitos. 4 Estudiar morfológicamente los cambios post-larvales de dos especies de Lamellodiscus parásitos del sargo picudo. 0.3 Materiales y Métodos Se han desarrollado en cada estudio específico de los correspondientes apartados. 0.4 Análisis morfométricos, moleculares y ecológicos de los parásitos de Diplodus puntazzo (Walbaum 1792) (Sparidae) en el Mediterráneo español: implicaciones en acuicultura 0.4.1 Introducción Las condiciones en acuicultura implican estrés para los peces y, a su vez, favorecen la transmisión de patógenos y un elevado número de infecciones que en ocasiones han sido relacionadas con importantes pérdidas económicas (Ogawa, 1996; Murray y Peeler, 2005). Muchos de los patógenos causantes de enfermedades en las granjas se encuentran parasitando los peces circundantes; de este modo las diferentes especies de parásitos pueden ser intercambiadas por los peces cultivados y salvajes. El sargo picudo es una de las especies con mayor potencial para ser introducida en la acuicultura mediterránea (Abellán y Basurco, 1999) debido a sus elevadas tasas de crecimiento y a su índice de transformación del alimento (Favaloro et al., 2002; Hernández et al., 2003). En España su cultivo se encuentra en una fase experimental (Hernández et al., 2001, 2002, 2003; Pajuelo et al., 2008; Nogales Mérida et al., 2010; Almaida-Pagán et al., 2011) y su introducción se ha visto comprometida por la presencia de patógenos (Athanassopoulou et al., 2005; Merella et al., 2005; Katharios et al., 2006; Montero et al., 2007; Álvarez-Pellitero et al., 2008; Golomazou et al., 2009; Rigos y Katharios, 2010; Sánchez-García et al., 2011). Estos patógenos causantes de patologías pueden tener su origen de los peces salvajes que se encuentran circundantes, y el sargo picudo es una de las especies que se encuentra más frecuentemente en los alrededores de las granjas (Dempster et al., 2002). Para tratar de prevenir y desarrollar controles efectivos de las posibles infecciones cruzadas es necesario un estudio en profundidad de las especies que parasitan el sargo picudo tanto en la naturaleza como en las instalaciones acuícolas (Hutson et al., 2007; Rigos y Katharios, 2010). El objetivo de este trabajo es conocer las especies parásitas del sargo picudo en la naturaleza y analizar el efecto de las condiciones de cautividad sobre las mismas. 0.4.2 Materiales y Métodos Se analizaron un total de 70 ejemplares salvajes capturados en dos localidades del Mediterráneo español: 50 procedentes del Mar Menor (San Pedro del Pinatar, Región de Murcia), y 20 de Santa Pola (Comunidad Valenciana). Treinta peces procedentes del Mar Menor fueron sacrificados y congelados inmediatamente. Para el estudio del efecto de las condiciones de cultivo en los parásitos, 20 peces procedentes del Mar Menor se transportaron vivos y se mantuvieron en las instalaciones de la planta de acuarios de la Universidad de Valencia (SCSIE). Diez peces fueron sacrificados a los 10 y 20 días de cautividad respectivamente. Primero se examinó la superficie externa de los peces, incluyendo la piel, las aletas, la cavidad oral y la cavidad opercular, con el fin de detectar ectoparásitos. Posteriormente, se analizaron separadamente las branquias, los diferentes órganos de los sistemas digestivo y excretor, y el corazón. Por último, se analizaron el cerebro y los ojos, así como la musculatura circundante a las cinturas pélvica y escapular. Los parásitos se conservaron en etanol 70% para su examen morfológico y en etanol 100% para su estudio molecular. Los mixozoos se detectaron mediante el análisis de los órganos frescos. El análisis morfológico se llevó a cabo mediante el análisis de muestras representativas de especímenes adultos que fueron teñidos con acetocarmín férrico (Georgiev et al., 1986), se deshidrataron y se montaron en preparaciones permanentes con bálsamo de Canadá. Para el análisis de los monogeneos del género Lamellodiscus, sub-muestras representativas de 30 individuos se montaron en preparaciones semipermanentes de glicerogelatina. Los crustáceos se examinaron en agua destilada o en glicerogelatina. Las especies cuya identificación morfológica resultó confusa, se analizaron morfométricamente especímenes adultos, con la ayuda de un tubo de dibujo. Para aquellas especies difíciles de clasificar morfológicamente se realizaron comparaciones genéticas. Se extrajo el ADN de tres a cuatro individuos de L. falcus s.l., L. theroni s.l. (Monogenea) y Peracreadium characis (Stossich 1886) (Digenea). Posteriormente. se amplificaron las secuencias de las regiones 18S e ITS1 en el caso de los monogeneos, y ITS1 e ITS2 de P. characis. Finalmente, las secuencias resultantes se alinearon usando el programa BioEdit v. 7.0.5. (Hall, 1999) y se compararon con secuencias cercanas filogenéticamente, obtenidas de la base de datos de Genbank, con ayuda de los programas BLAST (Altschul et al., 1990) y MEGA 4.1 (Tamura et al., 2007). Para todas las especies de parásitos se calcularon la abundancia media y la prevalencia, con intervalos de confianza, (según Bush et al. 1997); excepto para los mixozoos, para los que sólo fueron calculadas las prevalencias. Para detectar diferencias significativas entre las distintas muestras de peces, se llevó a cabo la comparación de las prevalencias y abundancias entre las muestras procedentes de las dos localidades, y entre las muestras salvajes y cautivas de sargo picudo. Los análisis se realizaron con el programa Quantitative Parasitology 3.0 (Reiczigel y Rózsa, 2005). 0.4.3 Resultados Todos los sargos picudos analizados estaban parasitados por al menos cuatro especies parásitas. En total se detectaron 19 especies, 15 de ellas en peces procedentes del Mar Menor y 11 en peces de Santa Pola. Todos los parásitos fueron identificados hasta nivel de especie, excepto Ceratomyxa sp., Galactosomum sp. y Microcotylidae gen. sp. Los peces procedentes de ambas localidades compartían un total de siete especies parásitas. Se encontraron diferencias significativas en las abundancias medias entre las muestras de peces salvajes del Mar Menor y Santa Pola. La mayor abundancia se detectó en los peces procedentes del Mar Menor, que presentaron ocho especies que no estaban presentes en los peces de Santa Pola. Los peces procedentes de Santa Pola estaban parasitados por 4 especies que no se encontraron en los peces del Mar Menor. La carga parásita de los peces del Mar Menor, entre los que se encontraron la mayoría de las especies de monogeneos, el mixozoo y dos especies de digeneo, disminuyó gradualmente con el tiempo. La abundancia total parasitaria disminuyó significativamente después de 10 días de cautividad. A los 20 días la abundancia total de parásitos también disminuyó significativamente: los peces continuaron parasitados por 3 especies de Lamellodiscus, presentando mayores abundancias, y dos especies de parásitos estrictos del medio interno, Cardiocephaloides longicollis (Rudolphi 1819), en cerebro, y Ceratomyxa sp. en vesícula biliar. Análisis morfológicos y moleculares El análisis morfológico de las especies de monogeneos del género Lamellodiscus permitió comparar los resultados obtenidos con las descripciones originales. Los morfotipos eran similares a L. falcus y L. theroni (referidos como L. falcus sensu stricto y L. theroni sensu stricto). Los resultados del análisis morfométrico de los especímenes del digeneo Peracreadium sp. procedentes de ambas localidades se compararon con las descripciones originales, siendo sus medidas similares entre las dos localidades. En los análisis moleculares realizados para las especies de Lamellodiscus no se encontró ninguna diferencia cuando se compararon las secuencias aisladas de 18S de L. falcus s.l. y las obtenidas en GenBank de la especie L. ignoratus Palombi 1943. Cuando se compararon los aislados de 18S de L. theroni s.l. presentaron un porcentaje del 0% de disimilaridad y del 0.2% comparados con los de L. ergensi Euzet et Oliver 1966 procedentes de GenBank. Al comparar las secuencias de ITS1 obtenidos de L. falcus s.l. no se encontraron disimilaridades; sin embargo al comparar las mismas con las secuencias de L. ignoratus procedentes de GenBank, se encontraron unas disimilaridades entre 1.2 y 26.0%. Las disimilaridades entre secuencias procedentes de diferentes individuos de L. theroni s.l. se encontraron entre 0.0 y 0.2%, mientras que al ser comparadas con secuencias de L. ergensi obtenidas de GenBank estaban entre el 0.2 y el 14%. Durante el estudio molecular de los especímenes de Peracreadium sp. las secuencias obtenidas de 18S e ITS se compararon con las disponibles en GenBank de la especie P. characis. No se encontraron disimilaridades entre las secuencias de 18S aisladas de los especímenes procedentes de este estudio y las de la especie P. characis disponibles en GenBank. Las secuencias obtenidas de ITS no fueron disimilares entre ellas, mientras que cuando se compararon con las de la especie P. characis, la disimilaridad fue de 0.3% en todos los casos. 0.4.4 Discusión El sargo picudo presenta una comunidad de parásitos metazoos diversa en el Mediterráneo español. Algunas de las especies identificadas en el presente trabajo han sido previamente descritas en el Mediterráneo (Radujkovic y Euzet, 1989; Sasal et al., 1999; Bartoli et al., 2005; Mladineo, 2006; Gargouri Ben Abdallah y Maamouri, 2008) y un total de siete especies han sido citadas por primera vez en el sargo picudo en este estudio. Además, dos especies de parásitos previamente identificados en sargos picudos cultivados, se han encontrado por primera vez en peces salvajes. La mayoría de las especies parásitas encontradas son monoxenas (11 especies), ocho monogeneos y tres crustáceos; las especies heteroxenas (7 especies) corresponden principalmente a digeneos junto con una especie de mixozoo. Ningún nematodo ha sido registrado ni en este trabajo, ni en estudios anteriores. Análisis morfológicos y moleculares El estudio morfológico de las especies de Lamellodiscus muestra una clara concordancia entre la morfología de los morfotipos L. falcus s.l. y L. theroni s.l. y las descripciones de las especies L. falcus y L. theroni, siendo sin embargo sus dimensiones más similares a las proporcionadas para las especies L. ergensi y L. ignoratus. Finalmente, los resultados moleculares mostraron una variación intra-específica en las secuencias de ITS1 que se encuentra dentro del rango de variación dado por Kaci-Chaouch et al. (2008) para las especies L. ergensi y L. ignoratus. Por lo tanto, de acuerdo con Poisot y Desdevises (2010) y Poisot et al. (2011), y a pesar de las variaciones morfométricas, este tipo de divergencias moleculares en los especímenes de Lamellodiscus spp. no refuerza la separación de las especies (L. falcus vs. L. ignoratus and L. theroni vs. L. ergensi). Las variaciones intra-específicas debidas al hospedador combinadas con la posibilidad de la existencia de variaciones morfométricas causadas por las diferencias geográficas podrían explicar las variaciones morfológicas existentes en las especies de Lamellodiscus. La morfología de los especímenes de Peracreadium sp. se corresponde con la de P. characis, siendo sin embargo las medidas totales y parciales de los individuos españoles menores que las señaladas en su descripción (ver Bartoli et al., 1989). Los resultados moleculares obtenidos confirman que corresponden a la especie P. characis. Las diferencias encontradas al comparar las secuencias de ITS se encuentran entre las diferencias intra-específicas dadas por Jousson et al. (1999). Consecuentemente, el presente estudio extiende el rango de medidas de cada órgano y las dimensiones. Efecto de la cautividad sobre la fauna parásita La mayoría de los ectoparásitos y parásitos digestivos desaparecen en condiciones de cautividad, excepto los monogeneos Lamellodiscus spp., debido a la gran susceptibilidad de los parásitos a las condiciones de cultivo (Woo, 2006), como por ejemplo la calidad del agua, el estado de salud del pez y la alimentación. La desaparición de la mayoría de los parásitos externos contrasta con la supervivencia de aquellos que parasitan órganos internos, como la metacercaria de Cardiocephaloides longicollis, protegida por los tejidos cerebrales, y el mixozoo Ceratomyxa sp., protegido por la vesícula biliar. La información procedente de este estudio permite concluir señalando aquellos grupos de parásitos que pueden comprometer la salud del sargo picudo. Se trata principalmente de tres grupos: los mixozoos, los monogeneos microcotílidos, y los crustáceos. 0.5 Estudio de evaluación de riesgos parasitológicos del cultivo de Diplodus puntazzo en el Mediterráneo occidental: perspectivas de infecciones cruzadas con Sparus aurata 0.5.1 Introducción La autoridad en salud alimentaria de la Unión Europea (EFSA) es la agencia encargada del análisis de riesgos relacionados con la comida y la alimentación. De acuerdo con el EFSA (2008), el análisis de riesgos es un proceso científicamente basado en la evaluación, tanto cualitativa como cuantitativa, de la probabilidad y del impacto potencial de cualquier peligro o amenaza. En la guía EFSA (2009a), se expone la necesidad de desarrollar análisis de riesgos procedentes de patógenos en las instalaciones acuícolas. Este tipo de estudios ya se han llevado a cabo en diferentes países (e.g., Akoll et al., 2012; Hutson et al., 2007; Nowak, 2004), sin embargo, y a pesar de las recomendaciones del EFSA, no existe ningún estudio realizado para la acuicultura Mediterránea (EFSA, 2008; EFSA, 2009a; EFSA, 2009b). El objetivo de este estudio es llevar a cabo una evaluación de los riesgos parasitológicos para el cultivo del sargo picudo en el Mediterráneo español. Además se ha tenido en cuenta la posible existencia de infecciones cruzadas con cultivos de dorada (Sparus aurata). Para ello, se ha realizado un análisis cualitativo basado en los parásitos del sargo picudo y de la dorada previamente documentados. 0.5.2 Materiales y Métodos Siguiendo la guía EFSA (2008) se identificaron las especies de parásitos que presentaban una mayor probabilidad de proliferar en las instalaciones acuícolas (¿Identificación del peligro¿). Posteriormente, se caracterizó el riesgo basándose en las especies de parásitos que pueden causar patologías comprometiendo la salud de los peces, que son difíciles de controlar y que tienen prioridad inmediata para establecer unas estrategias de manejo adecuadas (¿Caracterización del peligro y evaluación de la exposición al mismo¿). Finalmente, se consideró la posibilidad de tratar las diferentes especies de parásitos consultando la bibliografía disponible (Schmahl y Mehlhorn, 1985, 1988; Schmahl y Taraschewsh, 1987; Schmahl et al., 1988; Woo, 2006; Noga, 2009). Los parásitos de la dorada también se estudiaron y se incluyeron en el trabajo debido a la proximidad taxonómica de ambas especies de peces y a que su cultivo se realiza en las mismas instalaciones que el sargo picudo. 0.5.3 Resultados En la dorada y el sargo picudo, los monogeneos son el, el grupo más diverso de parásitos seguido por el de los digeneos. Dieciséis de las especies parásitas descritas en dorada se identificaron también en el sargo picudo. Según los resultados obtenidos, ninguna especie de parásito implica una consecuencia ¿Extrema¿, ya que la mayor consecuencia, ¿Alta¿, fue asignada a las especies de parásitos Amyloodinium spp., Cryptocaryon irritans Brown 1951, una especie de ciliado no identificado, y Enteromyxum leei. La categoría de ¿Extrema¿ en la probabilidad de establecimiento y proliferación, fue asignada a diferentes grupos: una especie de ciliado (C. irritans), tres especies de mixozoos (Ceratomyxa sp., Ceratomyxa puntazzi Alama-Bermejo, Raga et Holzer 2011 y E. leei), tres especies de monogeneos (Lamellodiscus bidens, L. hilii y Sparicotyle chrysophrii) y una especie de copépodo (Caligus ligusticus Brian 1906). Los resultados procedentes del estudio de riesgo indican que los parásitos Amyloodinium spp., Cryptocaryon sp. y E. leei implican un ¿Alto¿ riesgo para el cultivo del sargo picudo en el Mediterráneo español. El monogeneo S. chrysophrii, el isópodo Gnathia vorax (Lucas 1849) y el copépodo C. ligusticus representan un riesgo ¿Moderado¿. La mayoría de estas especies de parásitos, a excepción del E. leei, pueden ser tratadas con sustancias antiparasitarias. 0.5.4 Discusión Este es el primer análisis de riesgos llevado a cabo en la acuicultura europea. La metodología empleada es directamente aplicable para cualquier otra especie de cultivo. Es importante incidir que el presente trabajo está basado en la información disponible actual, por lo tanto debería ser revisado en el futuro con la identificación de nuevas especies. Tres especies de parásitos representan un riesgo ¿Alto¿ para los cultivos del sargo picudo: Amyloodinium spp., C. irrintans y Enteromyxum leei. C. irritans y E. leei son conocidas por ser las responsables de elevadas mortalidades en los cultivos de sargo picudo y dorada (Le Breton y Marques, 1995; Athanassolpoulou et al., 1999; Golomazou et al., 2004). Los resultados obtenidos nos permiten saber que Amyloodinium spp. también debe ser considerado como uno de los parásitos de riesgo, debido a sus efectos negativos (Noga, 1996). Adicionalmente, Sparicotyle chrisophrii, Caligus ligusticus y Gnathia vorax representan un riesgo ¿Moderado¿ para los cultivos de sargo picudo en el Mediterráneo. Las infecciones causadas por S. chrisophrii han sido responsables de mortalidades masivas en los cultivos de dorada (Paperna, 1991; Alvárez-Pellitero et al., 1995) y de sargo picudo (Merella et al., 2005). En lo relativo a los crustáceos no se han registrado episodios importantes en el cultivo de espáridos en el Mediterráneo, pero debido a su elevada patogeneidad descrita en otras especies de peces y a su baja especificidad, los calígidos y los isópodos deben ser controlados y gestionados para prevenir futuros problemas en las instalaciones acuícolas. La mayoría de los parásitos que conllevan un riesgo importante para el cultivo del sargo picudo, han sido previamente identificados en los cultivos de dorada (protistas, mixozoos y el monogeneo S. chrisophrii). Estos datos indican la posibilidad de infecciones cruzadas que aumentarían las tasas de infección y podrían comprometer los cultivos de una de las especies fundamentales en la acuicultura Mediterránea. El presente análisis resalta la importancia de la evaluación de los riesgos en el conocimiento científico de la salud de los animales acuáticos. Los parásitos identificados como patógenos potenciales deben ser considerados en el establecimiento de nuevos cultivos, teniendo en cuenta, junto con la localización de las instalaciones, la fauna parasita de las especies circundantes, las corrientes marinas relacionadas con las jaulas vecinas y la posibilidad de contagio por patógenos procedentes de otras especies cultivadas. 0.6 Estudio comparativo de tres mecanismos de anclaje de monogeneos diplectánidos 0.6.1 Introducción La Familia Diplectanidae Monticelli 1903 es una familia de monogeneos monopistocotileos con especies en todo el mundo (Domingues y Boeger, 2008). Se trata de parásitos de peces que poseen un haptor característico compuesto por dos pares de ganchos grandes laterales conectados por unas barras medias, 14 ganchos marginales y, normalmente, una o dos estructuras mediales llamadas lamelodiscos (Bychowsky, 1957; Desdevises, 2001; Domingues y Boeger, 2008). Los lamelodiscos están formados por grupos de escleritos dorsales y ventrales, cuya morfología, disposición y número varía entre los diferentes grupos de diplectánidos (Domingues y Boeger, 2008; Yamaguti, 1963). Los diplectánidos son parásitos muy comunes en el Mediterráneo, Furnestinia echeneis, en Sparus aurata, Lamellodiscus spp. en Diplodus puntazzo, y Diplectanum aequans, en Dicentrarchus labrax L. (Cruz-e-Silva et al., 1997; Dezfuli et al., 2007; Katharios et al., 2006; Merella et al., 2005; Mladineo, 2007; Toksen, 2006; Vagianou et al., 2004, 2006). Las diferencias en la estructura del háptor están asociadas a la diversidad de estrategias de anclaje de las diferentes especies de monogeneos (Bychowsky, 1957; Dezfuli et al., 2007; Kearn, 1997), y estas diferencias implican a su vez diferentes daños en los tejidos del hospedador. El objetivo de este estudio es describir y comparar el mecanismo de anclaje de F. echeneis y de dos especies del género Lamellodiscus parásitos del sargo picudo. Los resultados obtenidos se compararán con el anclaje del diplectánido más patogénico D. aequans. 0.6.2 Materiales y Métodos Los parásitos se aislaron de peces procedentes de dos granjas diferentes situadas en el Mediterráneo español (Burriana (Castellón) y San Pedro del Pinatar (Murcia)). Los peces fueron sacrificados y se extrajeron las branquias. Se analizaron los arcos branquiales derechos para la observación in vivo de los monogeneos. Los arcos izquierdos se fijaron en formalina tamponada para la realización de los estudios histológicos y de microscopia electrónica de barrido (SEM). Para su adecuada clasificación y observación, 20 especímenes de cada una de las especies estudiadas se montaron en preparaciones semipermanentes de glicerogelatina. Los arcos branquiales fijados en formalina fueron embebidos en parafina, seccionados y teñidos con hematoxilina y eosina. Para el estudio realizado con SEM, cinco parásitos de cada especie fijados en formalina se deshidrataron, se pasaron por el punto crítico de secado y se les metalizó con oro-paladio, para ser observados posteriormente en el equipo de microscopia electrónica HITACHI S-4100. El estudio del háptor se realizó mediante el análisis de los especímenes de las diferentes especies utilizando diferentes técnicas microscópicas: Microscopio óptico para las observaciones in vivo, la toma de medidas y el análisis de los cortes histológicos y microscopio electrónico, para la observación de la superficie de los monogeneos. El estudio se completó con cortes histológicos de F. echeneis y D. aequans anclados en el tejido branquial, procedentes de la colección del Servicio de Diagnóstico de enfermedades de Peces de la Universidad Autónoma de Barcelona. 0.6.3 Resultados Anclaje de Furnestinia echeneis El háptor de F. echeneis está formado por un solo lamelodisco, cóncavo, hemi-elipsoidal y abierto ventralmente, dos pares de ganchos principales localizados a ambos lados del háptor, las barras medias dorsales y ventrales y 14 pequeños ganchos marginales. El háptor está ventralmente rodeado por un velo de tegumento donde se encuentran los ganchos marginales. El tamaño del háptor experimenta cambios in vivo, se comprime y extiende. Las láminas esclerotizadas que forman el lamelodisco se desplazan entre ellas, disminuyendo o aumentando el diámetro del háptor a la vez que todos los ganchos presentes en el háptor están en constante movimiento. Furnestinia echeneis se ancla principalmente en el lado aferente de las laminillas branquiales primarias. Los parásitos se desplazan frecuentemente: el cuerpo del parasito se expande buscando un nuevo lugar donde anclarse, el háptor se expande y se desprende del tejido y finalmente se vuelve a anclar en el tejido adyacente. Cuando el háptor se desprende de las branquias, el epitelio del área de anclaje aparece abultado y rodeado por una depresión elíptica producto de la compresión del epitelio por el margen del háptor. En los cortes histológicos no se observa ninguna reacción inflamatoria asociada al anclaje del parásito. Anclaje de Lamellodiscus spp. El háptor de las especies de Lamellodiscus está dorso-ventralmente aplanado, triangular y en forma de ¿T¿. Está formado por dos lamelodiscos, dorsal y ventral, dos pares de ganchos principales situados en los extremos laterales del háptor, una barra ventral y dos dorsales, y 14 ganchos marginales distribuidos ventral y dorsalmente. Los lamelodiscos forman un orificio dorsal y ventral en el háptor cubierto por unas extensiones de tegumento. En los especímenes in vivo se observó que los lamelodiscos se extienden o comprimen mediante el desplazamiento de las lamelas en un movimiento telescópico. En las branquias los especímenes de Lamellodiscus sp. introducen la mayor parte del háptor en el espacio que existe entre las laminillas secundarias. Los parásitos normalmente se mantienen anclados, sin embargo de forma eventual pueden desplazarse a un espacio interlamelar distinto. En las secciones histológicas se observa que los lamelodiscos desplazan las laminillas secundarias, a la vez que los ganchos principales las atraen perforando profundamente las laminillas continuas, los ganchos pueden llegar a perforar los vasos sanguíneos observándose ligeras hiperplasias y micro hemorragias. No se detectan respuestas inflamatorias relacionadas con el anclaje de las especies de Lamellodiscus. Anclaje de Diplectanum aequans El háptor de D. aequans establece un contacto directo con el epitelio branquial de su hospedador D. labrax, con las espinas que forman el lamelodisco orientadas anteriormente y adheridas al epitelio. El tejido branquial del área de anclaje presenta una clara reacción inflamatoria junto con una hiperplasia extensa. 0.6.4 Discusión La combinación de las diferentes técnicas microscópicas y la observación de parásitos vivos y fijados, anclados y no anclados a los tejidos del hospedador, ha permitido interpretar el papel de cada elemento del háptor en el anclaje. Furnestinia echeneis se ancla en la zona aferente de las laminillas primarias mediante un efecto de succión ejercido por su único lamelodisco. El háptor succiona el epitelio branquial creando un abultamiento rodeado por una línea de depresión creada por los márgenes del epitelio. Los ganchos juegan un papel secundario en el anclaje, ayudando en los primeros estadios del anclaje, cuando el parásito ha cambiado de posición. A diferencia de F. echeneis, el tamaño de los lamelodiscos de las especies del género Lamellodiscus es similar a sus ganchos principales, por lo tanto parece que ambas estructuras son fundamentales para el anclaje de los parásitos. Los 4 ganchos principales perforan el epitelio de las laminillas secundarias representando 4 puntos de anclaje que impiden que se liberen los parásitos. Las laminillas que forman los lamelodiscos realizan un movimiento telescópico, de este modo, los lamelodiscos actúan como estructuras protráctiles empujando el tejido y resultando en la separación de las laminillas secundarias contiguas. Por lo tanto, la fuerza de empuje que ejercen los lamelodiscos es contraria a la tracción ejercida por los dos pares de ganchos. Las diferencias entre Lamellodiscus sp. y F. echeneis demuestran que estructuras similares con un origen común resultan en movimientos y estrategias de anclaje diferentes. El háptor de F. echeneis es demasiado grande para introducirse en el espacio interlamelar, razón por la cual necesita un anclaje basado en la succión. El anclaje de D. aequans y las patologías relacionas fueron estudiadas por Dezfuli et al. (2007). El háptor de D. aequans, al igual que las especies del género Lamelodiscus, se introduce en el espacio interlamelar y establece un contacto estrecho con los tejidos del hospedador. El contacto del parásito parece estar relacionado con la hiperplasia y la reacción inflamatoria del epitelio, que pasivamente atrapa el háptor del parásito impidiendo su liberación. Las principales lesiones relacionadas con los monogeneos están asociadas con su anclaje especifico (Kearn, 1997). Diplectanum aequans es la única especie de diplactánido que se ha relacionado con problemas en los peces (Dezfuli et al., 2007), ya que la hiperplasia y la inflamación causada en las laminillas secundaria compromete la eficiencia del tejido respiratorio. Del mismo modo, los ganchos principales de Lamelodiscus sp. perforan el tejido branquial, pudiendo llegar hasta los vasos sanguíneos y causando pequeñas hemorragias que del mismo modo podrían llegar a afectar el intercambio gaseoso de los tejidos. Por el contrario, el anclaje F. echeneis no afecta a las estructuras respiratorias y sólo causa un daño superficial. La información obtenida en el presente trabajo puede resultar útil en el diseño de tratamientos antihelmínticos considerando los diferentes modos de anclaje de cada una de las especies parásitas estudiadas. 0.7 Cambios morfológicos y de anclaje de Lamellodiscus theroni (Monogenea, Diplectanidae) durante su desarrollo en Diplodus puntazo (Sparidae) 0.7.1 Introducción Las especies del género Lamellodiscus son parásitos comunes de peces salvajes y cultivados en el Mediterráneo. Principalmente parasita las branquias del sargo picudo, Diplodus puntazzo (Dezfuli et al., 2007; Katharios et al., 2006; Mladineo, 2007; Toksen, 2006; Sánchez-García et al., 2013). A pesar de la gran cantidad de trabajos relacionados con especies del genero Lamellodiscus (Amine et al., 2007; Sánchez-García et al., 2001; Poisot y Desdevises, 2010) sólo existe un estudio del desarrollo de las larvas de Lamellodiscus realizado por Bychowsky (1961); sin embargo no se incluyen datos de la cronología del desarrollo de los parásitos. El presente capítulo provee de información acerca del desarrollo de las piezas esclerotizadas del háptor y del órgano copulador masculino, de la especie Lamellodiscus theroni en el tiempo, además de estudiar los cambios que se producen en las estrategias de anclaje a lo largo del desarrollo del háptor. 0.7.2 Materiales y Métodos Cuarenta sargos picudos infectados por Lamellodiscus theroni fueron capturados en el Mar Menor (Murcia) y se trasladaron a las instalaciones de la Universidad de Valencia. Estos peces actuaron como donantes de parásitos para infectar a un total de 150 sargos picudos sanos, procedentes de Grecia. La infección se realizó mediante 48h de cohabitación con los peces donantes. Después del periodo de infección, los peces se transfirieron a los tanques experimentales (de la planta de acuarios del SCIE) y se determinó ese día como el ¿día 0¿ del experimento. Desde este momento se sacrificaron diariamente 5 peces, durante 22 días. Se recolectaron los parásitos y se guardaron las branquias para posteriormente realizar análisis histológicos. Para el análisis morfológico de los especímenes, los monogeneos se montaron en preparaciones semipermanentes en glicerogelatina y se estudiaron mediante microscopía óptica. Los análisis histológicos se llevaron a cabo mediante el análisis de secciones de tejido teñido con hematoxilina-eosina. 0.7.3 Resultados Todos los parásitos se encontraron en las branquias. Se analizaron un total de 151 parásitos, encontrados en las branquias, que se clasificaron en diferentes fases en función de su grado de desarrollo. Se identificaron seis fases de desarrollo en L. theroni de acuerdo con las primeras observaciones de las diferentes estructuras esclerotizadas que se estudiaron. - Fase I (días 1 a 12; n=8): Estadio post-larval. Como estructuras de anclaje se observaron 14 ganchos marginales dispuestos circularmente en el háptor. Los ganchos presentaron forma de garfio. Su tamaño no varió a lo largo del desarrollo. - Fase II (días 5 a 15; n=14, más del 50% alcanzaron esta fase el día 8): Emergen los pares de ganchos principales dorsal y ventral. Se observó un aumento de la longitud transversal del háptor. - Fase III (días 7 a 8; n=2): Se caracterizó por la primera observación de la barra ventral. - Fase IV (días 8 a 16; n=16, más del 50% alcanzaron esta fase el día 11): Emergencia de la barra dorsal. - Fase V (días 9 al 16; n=20, más del 50% alcanzaron esta fase el día 14): Se observó cómo los lamelodiscos ventrales y dorsales iniciaron su desarrollo. - Fase VI (desde el día 15 hasta el 22; n=23, más del 50% alcanzaron esta fase el día 15): Los especímenes que se observaron en esta fase correspondían a parásitos adultos, presentando el órgano copulador y las estructuras esclerotizadas con su tamaño y forma definitiva. En el análisis de las muestras histológicas se observó que los especímenes correspondientes a la fase I utilizaban los 14 ganchos periféricos para anclarse a los tejidos del hospedador en superficies aplanadas del filamento primario o entre las laminillas secundarias. En las siguientes fases II, III y IV, que se caracterizaron por la aparición de los dos pares de ganchos y las barras ventral y dorsal, los parásitos se observaron anclados entre las laminillas secundarias mediante la acción de los ganchos principales que perforan los tejidos branquiales. En las últimas dos fases, V y VI, los especímenes desarrollan los lamelodiscos y el órgano copulador, por lo tanto se observó la acción de los lamelodiscos durante el proceso de anclaje de los parásitos adultos. 0.7.4 Discusión Este estudio indica que el crecimiento total y parcial de Lamellodiscus theroni varía con el tiempo, dependiendo de las necesidades biológicas de cada periodo de vida del parásito. Las post-larvas fase I fueron más grandes que las descritas en estudios previos (L. elegans 60-70 µm de longitud, Bychowsky, 1957). El desarrollo de las diferentes partes esclerotizadas del háptor de L. theroni siguió el mismo orden descrito previamente por Bychowsky (1957), sin embargo se observaron diferencias en los tiempos necesarios de cada estructura esclerotizada para alcanzar el tamaño y la forma definitiva. A diferencia de L. elegans (Bychowsky, 1957), los componentes de háptor de L. theroni no completan su desarrollo hasta la última fase descrita en este estudio. Estas diferencias podrían ser debidas a que los ganchos principales presentan tamaños y morfologías diferentes, siendo proporcionalmente mayores en L. theroni. Todas las piezas esclerotizadas del háptor fueron visibles en la fase V. Los lamelodiscos ventral y dorsal fueron observados por primera vez al mismo tiempo, de acuerdo con las observaciones de L. elegans hechas por Bychowsky (1957). El cuerpo de L. theroni creció relativamente despacio durante las primeras cinco fases, mientras que entre la fase V y VI experimentó el mayor incremento de longitud, una vez todas las piezas del háptor estuvieron presentes. Este tipo de crecimiento ya ha sido previamente descrito en otros monogeneos (Repullés-Albelda et al., 2011), invirtiendo los parásitos la mayor parte de su energía en desarrollar los órganos necesarios para garantizarse un anclaje estable y seguro. Una vez todas las estructuras de anclaje se han desarrollado, los parásitos ya pueden alimentarse, crecer y reproducirse. El estudio histológico permitió identificar los diferentes tipos de anclaje llevados a cabo por las fases post-larvas de L. theroni durante el desarrollo. En la fase I, los ganchos marginales fueron observados como las únicas estructuras de anclaje, tratándose de un anclaje no selectivo que junto con el pequeño tamaño de los parásitos incrementa la diversidad de las áreas branquiales que pueden colonizar los monogeneos. Con el incremento de tamaño de L. theroni surge la necesidad de un anclaje más estable, que se consigue con el desarrollo de los pares de ganchos principales, las barras medias, las barras dorsales y los lamelodiscos dorsal y ventral en las fases II, III, IV, V y VI respectivamente. A partir de la fase II los parásitos se sitúan en los espacios interlamelares, entre dos laminillas secundarias branquiales, tal y como fue descrito en estudios anteriores por Sánchez-García et al. (2011). El grado de lesiones causadas por los monogeneos monopistocotileos depende del tamaño y de la cantidad de ganchos. En el presente trabajo, se observó que las primeras fases post-larvas se anclan mediante los ganchos accesorios de menor tamaño que no han sido relacionados con lesiones aparentes, mientras que los ganchos principales presentes en los adultos pueden llegar a penetrar profundamente en el epitelio incrementando el número y la seriedad de la lesiones (Sánchez-García et al., 2011). Por lo tanto, durante el último periodo de la infección, los daños causados en las branquias empeoran. En las granjas, el hacinamiento de peces incrementa las cargas parasitarias (Dezfuli et al., 2007; Katharios et al., 2006; Mladineo, 2007; Toksen, 2006; Sánchez-García et al., 2013) y los peces son parasitados por monogenos correspondientes a diferentes fases larvarias con diferentes estrategias de anclaje y preferencias de hábitat, afectando áreas de las branquias más extensas. El conocimiento del desarrollo parasitario ayuda a establecer los intervalos necesarios durante los cuales se deben administrar los tratamientos antiparasitarios (Repullés-Albelda et al., 2012). En L. theroni la segunda generación de parásitos aparece 20 días después del periodo infectivo, por lo que un tratamiento basado en dos dosis separadas por un mínimo de 4 días podría resultar óptimo para la desparasitación de los peces. 0.8 Comparación del desarrollo post-larvario de las especies de Lamellodiscus. Descripción del desarrollo de Lamellodiscus falcus 0.8.1 Introducción El número de estudios relacionado con el desarrollo de los parásitos del género Lamellodiscus es muy escaso. Bychowsky (1966) estudió el desarrollo de Lamellodsicus elegans Bychowsky 1957, y más recientemente Sánchez-García et al. (2014b) siguió el desarrollo cronológico de las diferentes estructuras esclerotizadas de L. theroni Amine, Euzet et Kechemir-Issad 2007, parásito del sargo picudo Diplodus puntazzo. Los autores de los estudios anteriores encontraron diferencias en los momentos de desarrollo de las piezas esclerotizadas de L. elegans y L. theroni, debidas posiblemente a las diferencias morfológicas de los parásitos adultos. Clasificaciones previas del género Lamellodiscus spp. dividen las especies en grupos en función de la composición del háptor, de este modo las 8 especies presentes en D. puntazzo se clasifican en dos tipos morfológicos (Amine y Euzet, 2005): L. bidens Euzet 1984, L. elegans, L. falcus Amine, Euzet et Kechemir-Issad 2006, L. hilii Euzet 1984, L. ignoratus Palombi 1943 y L. impervius Euzet 1984 donde cada barra dorsal del háptor está formada por una única pieza; a diferencia de L. ergensi y L. theroni donde cada barra dorsal del háptor está formada por dos piezas. Estas diferencias morfológicas implican a su vez diferencias en el anclaje y consecuentemente, diferencias en otros aspectos ecológicos y patológicos (Sánchez-García et al., 2011), o incluso en el desarrollo (Sánchez-García et al. 2014b). En este trabajo se estudia el desarrollo de una tercera especie de Lamellodiscus spp., L. falcus en infecciones experimentales de D. puntazzo para recoger y comparar con los estudios anteriores los cambios morfológicos que se producen durante el desarrollo en el tiempo. 0.8.2 Materiales y Métodos Cuarenta sargos picudos infectados por Lamellodiscus falcus capturados en el Mar Menor (Murcia) se trasladaron a las instalaciones de la Universidad de Valencia. Estos peces actuaron como donantes de parásitos para infectar a un total de 120 peces sanos, procedentes de Grecia. La infección se realizó mediante 48h de cohabitación con los peces donantes. Después del periodo de infección, los peces se transfirieron a los tanques experimentales y este día se determinó como el ¿día 0¿ del experimento. Desde este momento se sacrificaron 5 peces diariamente durante 22 días. Se recolectaron los parásitos y se guardaron branquias para realizar análisis histológicos. Para el análisis morfológico de los especímenes, los monogeneos se montaron en preparaciones semipermanentes en glicerogelatina y se estudiaron mediante microscopia óptica. Los análisis histológicos se llevaron a cabo mediante el análisis de secciones de tejido teñido con hematoxilina-eosina. 0.8.3 Resultados - Fase I (días 1 al 12; n=8): Estadio post-larval. Como únicas estructuras de anclaje los especímenes observados de L. falcus presentaban 14 ganchos marginales dispuestos circularmente en el háptor. Los ganchos marginales presentaron forma de pequeños garfios. - Fase II (días 5 al 15; n= 12, más del 50% alcanzan esta fase el día 9): Emergen los pares de ganchos principales dorsal y ventral. - Fase III (días 7 al 8; n= 1): Se caracterizó por la observación de la barra ventral. - Fase IV (días 8 al 16; n= 11, más del 50% alcanzan esta fase el día 14): Emergencia de la barra dorsal. - Fase V (días 9 al 16; n=3, más del 50% alcanzan esta fase el día 14): Se observó cómo los lamelodiscos ventrales y dorsales iniciaban su desarrollo. - Fase VI (desde el día 14; n= 12, más del 50% alcanzan esta fase el día 15): Los especímenes que se observaron en esta fase correspondían a parásitos adultos, presentando el órgano copulador y las estructuras esclerotizadas con su tamaño y forma definitiva. En el análisis de las muestras histológicas se observó que los especímenes correspondientes a la fase I se localizaron principalmente en las zonas más basales de los filamentos branquiales, utilizando los 14 ganchos periféricos para anclarse a los tejidos del hospedador en superficies planas. En las siguientes fases II, III y IV, con la aparición de los dos pares de ganchos principales y las barras ventral y dorsal, los parásitos se observaron anclados entre las laminillas secundarias mediante la perforación de los tejidos branquiales. En las últimas dos fases, V y VI, los monogeneos desarrollaron los lamelodiscos que intervienen en el proceso de anclaje empujando las laminillas branquiales secundarias pinzadas por los ganchos principales. 0.8.4 Discusión El presente trabajo demuestra que en L. falcus el crecimiento total y parcial varía con el tiempo, en función de las demandas biológicas de cada periodo de vida de los parásitos. El desarrollo de las diferentes piezas esclerotizadas sigue la misma secuencia que L. theroni y L. elegans (Bychowsky, 1961; Sánchez-García et al., 2014b). Sin embargo, algunas diferencias fueron descritas en relación a los ritmos de desarrollo. La composición final y la disposición de las piezas del háptor pueden determinar el desarrollo de las especies de Lamellodiscus spp. Por ejemplo, y de acuerdo con la clasificación hecha por Amine y Euzet (2005) L. theroni corresponde al grupo de Lamellodiscus spp. que posee las barras dorsales formadas por dos piezas, mientras que en L. falcus y L. elegans sólo están formadas por una pieza. Lamellodiscus falcus desarrolla todas sus estructuras y alcanza su tamaño definitivo un día antes que L. theroni, quizás en este caso la velocidad de crecimiento viene determinada por el tamaño final de los componentes del háptor (de mayor envergadura en L. theroni). El tamaño de las primeras post-larvas estudiadas de L. falcus fue muy similar que las de L. theroni (Sánchez-García et al., 2014b) y fue más del doble que L. elegans descritas por Bychowsky (1961). En Sánchez-García et al. (2014b) se observó que los ganchos ventrales de L. theroni eran más grandes que los dorsales desde el principio de su desarrollo, sin embargo en L. falcus al igual que en L. elegans (Bychowsky, 1961), ambos pares de ganchos principales presentaban un tamaño similar en sus fases iniciales. Al igual que L. elegans, los dos pares de ganchos principales de L. falcus alcanzan su tamaño definitivo en la última fase del desarrollo (fase VI) (Sánchez-García et al., 2014b). Sin embargo, mientras que en L. theroni los ganchos principales no adquieren su morfología adulta hasta la fase VI (Sánchez-García et al., 2014b) en L. falcus en la fase III ya se observan las protuberancias características de la especie. Esto es similar a lo que ocurre con L. elegans, cuyos ganchos principales mostraron la forma definitiva antes de que los lamelodiscos fueran detectados (fase IV) (Bychowsky, 1961). El mayor tamaño y robustez de los ganchos de L. theroni podría necesitar un mayor tiempo de esclerotización para alcanzar su longitud y forma definitiva. Respecto al incremento de la longitud total de L. theroni y L. falcus durante el desarrollo, L. falcus creció desde la fase I, mientras que L. theroni no experimentó un incremento de longitud hasta la fase II, pudiendo ser debido a que los especímenes adultos de L. falcus presentan una mayor longitud media. La similitud en la secuencia de desarrollo entre L. theroni y L. falcus implica que las diferentes estrategias de anclaje a lo largo del desarrollo sean también similares, y así lo confirma el estudio histológico. Por lo tanto podemos identificar tres fases de anclaje durante el desarrollo en L falcus: i) primeras post-larvas ancladas a superficies planas con los 14 ganchos marginales; ii) fases de la II a la IV, post-larvas ancladas en los espacios interlamelares de las laminillas branquiales secundarias, los ganchos principales pinzan el tejido branquial; iii) fases V y VI, el desarrollo de los lamelodiscos confiere al anclaje del parásito una mayor estabilidad y fortaleza. Para concluir, aunque las estrategias de anclaje de los diferentes estados de desarrollo de Lamellodiscus spp. son similares, algunas diferencias pueden detectarse relacionadas con la diferente composición y dimensiones de los escleritos del háptor de los adultos de cada especie. El tiempo entre las diferentes fases parece ser más variable, siendo las especies mayores las que requieren de mayores tiempos de desarrollo. 0.9 Conclusiones 1. La fauna parásita de Diplodus puntazzo en el Mediterráneo español está compuesta por 19 especies parásitas. Siete de las especies identificadas en este trabajo han sido citadas por primera vez en D. puntazzo: Microcotyle sp., Magnibursatus bartolii, Steringotrema pagelli, Galactosomum sp., Cardiocephaloides longicollis, Caligus ligusticus y Gnathia vorax. Dos especies son nuevos hallazgos en peces salvajes que sólo habían sido registrados en granjas; los monogeneos Atrispinum seminalis y Sparicotyle chrysophrii. 2. Once de las especies parásitas encontradas fueron monoxenas, de fácil dispersión en condiciones de cautiverio y elevada densidad de peces: 8 monogeneos y 3 crustáceos. Entre las especies heteroxenas encontradas hubieron 7 trematodos y 1 especie de mixozoo. 3. Los especímenes de monogeneos del género Lamellodiscus encontradas en el presente presentan los rasgos taxonómicos de las especies L. theroni y L. falcus, sin embargo, sus dimensiones son más similares a las especies L. ergensi y L. ignoratus respectivamente. 4. Los estudios moleculares de las especies Lamellodiscus falcus sensu lato y L. theroni sensu lato mostraron divergencias intraespecíficas en el gen ITS1, sin embargo esta variación se encuentra dentro del rango de las variaciones intraespecíficas indicadas en estudios previos para las especies de L. ergensi y L. ignoratus. Este tipo de divergencias moleculares en los especímenes de Lamellodiscus spp. no refuerza la separación de las especies a pesar de sus diferencias morfológicas. 5. Los especímenes procedentes del Mediterráneo español analizados del trematodo Peracreadium characis aumentan el rango de medidas característico para cada órgano, ya que las dimensiones de los individuos analizados en el presente trabajo fueron menores que las descritas anteriormente. Los estudios moleculares confirman que se trata de diferencias intraespecíficas. 6. La mayoría de las especies parásitas de la piel, branquias y sistema digestivo desaparecen en condiciones de cautividad, a excepción de los monogeneos del género Lamellodiscus. Sin embargo, las especies parásitas del medio interno sobreviven, como es el caso de Cardiocephaloides longicollis y Ceratomyxa sp. 7. Tres especies parásitas representan un riesgo ¿Alto¿ para los cultivos del Diplodus puntazzo en el Mediterráneo español: Amyloodinium sp., Cryptocaryon sp. y Enteromyxum leei. Adicionalmente, otras tres especies representan un riesgo ¿Moderado¿: Sparicotyle chrisophrii, Caligus ligusticus y Gnathia vorax. La mayor parte de las especies parásitas que representan un riesgo importante para el cultivo de D. puntazzo han sido previamente identificadas en cultivos de Sparus aurata. Es importante tener en cuenta las posibles infecciones cruzadas en los cultivos de ambas especies. 8. Los lamelodiscos de Lamellodiscus falcus y L. theroni están formados por láminas esclerotizadas superpuestas. Contrariamente a lo que las publicaciones previas indican, estos lamelodiscos no actúan como una ventosa. Cada lámina se desplaza como una única pieza describiendo un movimiento telescópico que produce un empuje de los epitelios branquiales y la subsiguiente separación de las laminillas branquiales secundarias. La fuerza de empuje ejercida por el lamelodisco durante el anclaje es contraria a la fuerza de tracción que ejercen los ganchos principales. De este modo se consigue un anclaje estable y eficiente para los parásitos. 9. Furnestinia echeneis posee un único lamelodisco de tipo ¿dividido¿, cada una de las mitades de las láminas esclerotizadas se desplaza independientemente, hecho que les permite deslizarse entre sí postero-lateralmente. El lamelodisco de F. echeneis es demasiado grande para introducirse en el espacio que existe entre las laminillas branquiales secundarias, por lo que se ancla como una ventosa en zonas de superficie amplia y lisa del filamento branquial. El lamelodisco único actúa cómo una bomba creando un vacío y fijando el monogeneo al tejido branquial. Los dos pares de ganchos ventrales y dorsales actúan como elementos secundarios en el anclaje. 10. El háptor de Diplectanum aequans penetra en el interior del espacio interlamelar y establece un contacto íntimo con el tejido branquial del hospedador. Los ganchos y las espinas que forman el háptor, producen alteraciones extensas en el tejido epitelial en el lugar de anclaje y en los alrededores. La hiperplasia, edema y reacción inflamatoria del epitelio atrapan pasivamente el háptor del parásito, impidiendo que se libere. 11. Los diferentes mecanismos de anclaje de los diplectánidos explican las diferentes patologías que provocan. El mecanismo de anclaje de D. aequans implica severas alteraciones en el epitelio branquial con inflamaciones que rodean y sustentan al háptor. Diplectanum aequans y Lamellodiscus spp. se anclan en las laminillas secundarias, causando daños y afectando la función respiratoria debido a la hiperplasia, la fusión lamelar y el daño causado a las estructuras vasculares. Por el contrario, F. echeneis al anclarse fuera de las laminillas secundarias, no afecta a las estructuras respiratorias y sólo causa daños leves relacionados con las perforaciones superficiales causadas por los ganchos. 12. La información dada acerca del anclaje de las diferentes especies de diplectánidos es útil para diseñar tratamientos orientados efectivos: el anclaje D. aequans es pasivo, por lo que los parásitos no se desprenden fácilmente, con lo que sólo tratamientos agresivos y parasiticidas pueden resultar efectivos. El anclaje de F. echeneis y Lamellodiscus spp. es total o parcialmente activo, por lo que pueden desprenderse más fácilmente con tratamientos con productos antihelmínticos, como los que tienen efectos espasmódicos sobre los parásitos. 13. Durante el desarrollo postlarvario de las especies Lamellodiscus theroni y L. falcus han sido identificadas seis fases de desarrollo, en función del desarrollo de las piezas esclerotizadas que forman el háptor y el órgano copulador: I, con 14 ganchos periféricos; II, con ganchos dorsales y ventrales; III y IV, con barras ventral y dorsales, respectivamente; V, con lamelodiscos dorsales y ventrales; y VI, con órgano copulador desarrollado. 14. Tres fases resultan cruciales para la estrategia de anclaje de los parásitos durante el desarrollo postlarval de las especies de Lamellodiscus,: fase I, anclaje realizado únicamente por los 14 ganchos marginales, que permiten al parásito anclarse sobre superficies planas, con mayor capacidad de desplazamiento aunque menos estables; fase II, el uso de los ganchos dorsales y ventrales confiere menor movilidad al tiempo que anclan con mayor firmeza a las laminillas secundarias en el espacio interlamelar; y por último, en la fase V, el desarrollo de los lamelodisco implica la presencia de una nueva estructura de anclaje que ejerce una fuerza contraria a la de los ganchos principales incrementando la eficiencia del anclaje. 15. A pesar de las diferencias entre los háptores de L. falcus, L. theroni y L. elegans, las tres especies siguen un patrón de desarrollo muy similar. La similitud en la secuencia de desarrollo de los escleritos del háptor en L. falcus y L. theroni implica que la secuencia ontogenética de estrategias de anclaje serán también similares. Se encontraron algunas diferencias en relación a los ritmos de desarrollo de algunos escleritos aparentemente relacionadas con las dimensiones definitivas específicas de cada especie.