Development and validation of new methods for the study of oxidative stress by imaging flow cytometry

Resumen

El estrés oxidativo se origina debido a un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y los mecanismos celulares antioxidantes. Este desequilibrio en el estado normal redox puede causar efectos tóxicos a través de la producción de radicales libres y peróxidos, que dañan a componentes esenciales de la célula, como proteínas, lípidos y ADN. Actualmente se cree que el estrés oxidativo está relacionado con los mecanismos en un gran número de enfermedades degenerativas y cáncer, y también se le atribuye un papel importante en el proceso de envejecimiento. Las principales dificultades en el estudio de los procesos del estrés oxidativo derivan de la corta vida media de los ROS y de la localización de su acción fisiológica, restringida a ciertos tipos celulares, y confinada en compartimentos subcelulares específicos. Por ello, el desarrollo de métodos basados en el análisis de células individuales y de sus compartimentos subcelulares es de gran importancia. Asimismo, el estudio de la implicación del estrés oxidativo en las respuestas inmunitarias se vería favorecido por el desarrollo de métodos que permitan el análisis en muestras de sangre entera. En los últimos veinte años, la capacidad de análisis multiparamétrico de células individuales de la Citometría de Flujo (FCM), que permite evaluar simultáneamente parámetros funcionales y bioquímicos, se ha aplicado al estudio del estrés oxidativo. Más recientemente, una nueva tecnología de análisis celular; la Citometría de Imagen en Flujo (IFCM) aporta sustanciales mejoras con respecto a la FCM convencional, al combinar en un único sistema las capacidades de la microscopia y la citometría. Esta tecnología ofrece nuevas capacidades analíticas y permite multitud de aplicaciones más allá de los límites actuales de la Citometría de Flujo y la Microscopia. El objetivo principal de este trabajo es comprobar la capacidad de esta nueva tecnología mediante la optimización, puesta a punto y validación de un método basado en Citometría de Imagen en Flujo para evaluar las respuestas oxidativas asociadas a la fagocitosis y a la activación de NF-kB. Para ello hemos desarrollado una serie de ensayos in vitro en muestras de sangre entera y modelos celulares de relevancia inmunológica.