Estudio del secretoma de las células madre de tejido adiposo y de péptidos PTHrP en células articulares osteoartríticas

Resumen

La osteoartritis (OA) es la patología articular más frecuente y la causa más importante de discapacidad en personas de edad avanzada. Existe un gran interés en el estudio de nuevas dianas terapéuticas que puedan facilitar la prevención o tratamiento de la OA, ya que actualmente no existe ningún tratamiento eficaz. En este trabajo, se han abordado dos posibles nuevas estrategias: el medio acondicionado (MA) de las células madre del tejido adiposo (ASCs) y los péptidos derivados de la proteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP). Las ASCs tienen un elevado potencial terapéutico. Numerosos estudios han mostrado que ejercen efectos beneficiosos en diferentes modelos de enfermedad a través de un aumento de la regeneración tisular debida, en parte, a su capacidad de diferenciación multipotencial. Sin embargo, estos beneficios también se deben a la disminución de las respuestas inmunitarias e inflamatorias, que parece depender de la actividad paracrina de las ASCs. Como resultado, se ha empezado a estudiar el secretoma de estas células para su posible empleo como terapia en la clínica. En nuestro estudio se ha analizado el efecto del MA de las ASCs en las células inflamatorias humanas monocitos y macrófagos. En monocitos estimulados con lipopolisacárido (LPS), el MA reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO), y normaliza el potencial de membrana mitocondrial, respecto a las células estimuladas con LPS. Además, el MA también disminuye significativamente los niveles de PGE2 y las funciones celulares de migración celular de monocitos y la fagocitosis de macrófagos. Nuestros resultados sugieren que el MA podría utilizarse en el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para enfermedades inflamatorias. Varios estudios han mostrado los beneficios potenciales de las ASCs en la reparación del cartílago. En nuestro trabajo se ha puesto de manifiesto que el MA puede regular diferentes mediadores clave implicados en la degeneración del cartílago, en condrocitos osteoartríticos. Así, hemos observado que el MA aumenta la expresión de colágeno de tipo II en condrocitos osteoartríticos estimulados con interleucina(IL)-1?. En estas condiciones, el MA disminuye la actividad metaloproteinasa (MMP) en sobrenadantes celulares, así como los niveles de proteínas y ARNm de MMP-3 y MMP-13. Además, el MA aumenta los niveles de IL-10 y contrarresta los efectos de IL-1? en la producción del factor de necrosis tumoral-? (TNF-?), IL-6, PGE2, NO, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL19, CCL20, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5 y CXCL8. También reduce la expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2), prostaglandina E sintasa microsomal (mPGES)-1 y NO sintasa inducible (iNOS). Estos efectos pueden ser debidos a la inhibición de la activación del factor nuclear-?B (NF-?B). El envejecimiento y la exposición a diferentes tipos de estrés determinan el fenotipo condrocítico en la OA. La exposición crónica a mediadores inflamatorios puede conducir a la senescencia inducida por estrés, que contribuye a la degeneración del cartílago en la OA. Este estudio ha demostrado que el MA de las ASCs puede regular la senescencia inducida por estrés en condrocitos osteoartríticos. Nuestros resultados indican que el MA disminuye la aparición de marcadores de senescencia inducidos por IL-1?, como la actividad ?-galactosidasa asociada a senescencia (SA-?-Gal), la acumulación de focos de histona fosforilada H2AX (?H2AX) y los cambios morfológicos con formación de fibras de estrés de actina. Estos efectos son el resultado de la reducción de diferentes mediadores y vías de señalización: el estrés oxidativo, la activación de protein-cinasas activadas por mitógenos (MAPKs), la expresión de caveolina-1 y p21, y la acetilación de p53, la cual está relacionada con un aumento en la expresión de Sirt1. Consecuentemente, el MA puede ejercer efectos protectores en la degeneración de los tejidos articulares, contrarrestando la senescencia prematura de condrocitos osteoartríticos inducida por estrés inflamatorio. La OA se ha asociado con un metabolismo alterado del hueso subcondral. Ello justifica nuestro interés en el estudio de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la modificación del metabolismo óseo. Se han determinado los efectos de tres péptidos PTHrP: PTHrP (1–37) (N-terminal), PTHrP (107–111) y PTHrP (107–139) (C-terminales), sobre la producción de mediadores inflamatorios y degradativos, y la aparición de características senescentes inducidas por estrés inflamatorio en osteoblastos humanos osteoartríticos. La incubación con IL-1? de estas células en cultivo primario conduce a un aumento en la expresión de los marcadores de senescencia SA-?-Gal, ?H2AX, p16, p21, p53 y caveolina-1, mientras que el tratamiento con PTHrP (107–111) o PTHrP (107–139) reduce significativamente estos parámetros. Los tres péptidos favorecen la función osteoblástica, con una mayor eficacia de PTHrP (107–139). Además, los tres péptidos PTHrP disminuyen la expresión génica de MMP-1 y MMP-3, mientras que únicamente los C-terminal disminuyen la producción de IL-6, así como de PGE2, que es consecuencia de una menor expresión de COX-2. PTHrP (107–139) reduce también la liberación de TNF-?. Estos efectos antiinflamatorios están relacionados con la reducción de la activación de NF-?B por ambos péptidos, y de la proteína activadora-1 (AP-1) por parte de PTHrP (107–139). Nuestros resultados indican que la actividad antisenescente y antiinflamatoria de estos péptidos radica en la región C-terminal de PTHrP, y sugieren que estos fármacos podrían tener aplicaciones en enfermedades inflamatorias crónicas como la OA. Osteoarthritis (OA) is the most frequent joint disorder and an important cause of disability in the elderly. There is great interest in the study of new therapeutic targets that may facilitate the prevention or treatment of OA, since there is currently no effective treatment. In this work, we have addressed two possible new strategies: conditioned medium (CM) from stem cells from adipose tissue (ASCs) and parathyroid hormone–related protein (PTHrP) derived peptides. ASCs have a significant therapeutic potential. Numerous studies have shown that ASCs exert beneficial effects in various models of disease through the enhancement of tissue regeneration by their multipotential differentiation. However, these benefits are also due to the downregulation of immune and inflammation responses, which are thought to depend on their paracrine activity. As a result, there has been a growing interest in the study of the secretome from these cells for possible clinical use. Our study has analized the effect of conditioned medium (CM) from ASCs in inflammatory cells, monocytes and macrophages. In monocytes stimulated with lipopolysaccharide (LPS), CM reduces the production of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) and controls the mitochondrial membrane potential. Moreover, CM significantly reduces the levels of PGE2 and cellular function of monocyte migration and phagocytosis by macrophages. Our results suggest that CM could be used in the development of therapeutical approaches for inflammatory diseases. A number of studies have shown the potential benefits of ASCs for cartilage repair. Our study shows that CM may regulate a number of key mediators involved in cartilage degeneration in osteoarthritic chondrocytes. We have observed that CM enhances type II collagen expression in osteoarthritic chondrocytes stimulated with interleukin-1? (IL-1?). In these conditions, CM reduces matrix metalloproteinase (MMP) activity in cell supernatants as well as the levels of MMP-3 and MMP-13 protein and mRNA. In addition, CM increases IL-10 levels and counteracts the stimulating effects of IL-1? in the production of tumor necrosis factor-? (TNF-?), IL-6, PGE2, NO, CCL2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, CCL-8, CCL-19, CCL20, CXCL-1, CXCL-2, CXCL-3, CXCL-5 and CXCL-8. It also reduces cyclooxygenase-2 (COX-2), microsomal prostaglandin E synthase (mPGES)-1 and inducible NO synthase (iNOS) expression. These effects may be due to the inhibition of nuclear factor-?B (NF- ?B) activation. Aging and exposure to different stresses determine the chondrocyte phenotype in OA. Chronic exposure to inflammatory mediators might lead to stress-induced senescence that contributes to cartilage degeneration in OA. This study has demonstrated that CM from ASCs can regulate stress-induced senescence in osteoarthritic chondrocytes. Our results indicate that CM downregulates senescence markers induced by IL-1?. Such markers include senescence-associated ?-galactosidase activity (SA-?-Gal), accumulation of phosphorylated histone H2AX (?H2AX) foci and morphological changes with formation of actin stress fibers. These effects are the result of a reduction in different mediators and signalling pathways: oxidative stress, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) activation, caveolin-1 and p21 expression and p53 acetylation, which is related to an enhanced Sirt1 expression. Consequently, CM may exert protective effects in degenerative joint conditions tissue by countering the premature senescence of osteoarthritic chondrocytes induced by inflammatory stress. OA is also associated with altered metabolism in subchondral bone. This justifies our interest in therapeutic strategies aimed at the modification of bone cell metabolism. We have investigated the effects of three PTHrP derived peptides: PTHrP (1–37) (N-terminal), PTHrP (107–111) and PTHrP (107–139) (C-terminal) on the production of inflammatory and catabolic mediators, and the appearance of senescent characteristics induced by inflammatory stress in human osteoarthritic osteoblasts. Incubation of these primary cells with IL-1? leds to an increased expression of senescence markers SA-?-Gal activity, ?H2AX foci, p16, p21, p53 and caveolin-1. PTHrP (107–111) and PTHrP (107–139) significantly reduced all these parameters. These peptides improve osteoblastic function, PTHrP (107–139) showing a greater efficiency. All three PTHrP derived peptides reduce gene expression of MMP-1 and MMP3, while only C-terminal peptides decrease the production of IL-6 and PGE2, which is the consequence of COX-2 downregulation. PTHrP (107–139) also reduces TNF-? release. Such anti-inflammatory effects are related to the reduction of NF-?B activation by both peptides and activator protein-1 (AP-1) by PTHrP (107–139). Our data support an anti-senescence and anti-inflammatory role for the C-terminal moiety of PTHrP with potential applications in chronic inflammatory conditions such as OA.