Study of Thermotoga maritima ß-galactosidaseimmobilization, engineering and phylogenetic analysis

Resumen

La actividad de las lactasas fue descrita por Beijerink en 1889. El origen de dicha actividad era la ß-galactosidasa de la levadura Kluyveromyces lactis capaz de hidrolizar la lactosa en sus dos componentes, galactosa y glucosa. En la actualidad las ß-galactosidasas tienen dos aplicaciones principales, por un lado se utilizan para la obtención de productos libres en lactosa y por otro lado para la síntesis de galactooligosacáridos (GOS), a algunos de los cuales se les han asociado propiedades prebióticas. Esta doble capacidad de la enzima se da gracias al mecanismo de retención que comparte con otras proteínas del clan GH-A en la clasificación del CAZy.En este trabajo hemos explorado la posibilidad del uso de una ß-galactosidasa termoresistente (TmLac) procedente de una bacteria extremófila, Thermotoga maritima. Utilizando esta enzima como herramienta de estudio se han desarrollado tres objetivos distintos: 1- La inmovilización de la enzima a soportes para facilitar su uso industrial. Para ello se han utilizado dos aproximaciones distintas. Por un lado la inmovilización covalente a esferas magnéticas activadas con residuos epoxi. Por otro, la inmovilización a celulosa y quitina basada en el etiquetado de la TmLac con dominios de unión a carbohidratos (CBMs). La TmLac se ha logrado inmovilizar mediante ambos métodos permitiendo su reciclado. 2- Ingeniería enzimática para la mejora de las propiedades transglicosilantes. Mediante el modelado estructural de la TmLac se ha estudiado qué residuos de la proteína podrían ser determinantes en el proceso de transglicosilación. Mediante mutagénesis dirigida se han hecho un total de 12 substituciones de residuos del centro catalítico. En el mejor de los casos se ha conseguido duplicar la síntesis del GOS mayoritario producido por esta enzima, la ß-3’-galactosil-lactosa. 3- Estudio filogenético de la familia GH2 del CAZy. Algunas de las ß-galactosidasas mejor descritas y más utilizadas pertenecen a esta familia, al igual que la TmLac. Estudios prospectivos han demostrado que el extremo N-terminal de estas enzimas se encuentra muy conservado, pero existe una enorme variabilidad en el extremo C-terminal. Es por ello que mediante el uso de herramientas bioinformáticas se ha realizado un estudio detallado de la arquitectura de dominios, así como un estudio filogenético que podrían ayudar en un futuro a la búsqueda de nuevas enzimas candidatas para la síntesis de GOS.