Caracterización genética y molecular de la familia fosfoglicerato quinasa de Arabidopsis thaliana

Resumen

La glicólisis fue la primera gran ruta metabólica dilucidada, a nivel bioquímico, alrededor de los años 40 del siglo XX. Sin embargo, la existencia en plantas tanto de dos rutas glicolíticas, que actúan en paralelo en el citosol y los plastos, como de varias isoformas para cada enzima, y la presencia de células autótrofas y heterótrofas, donde la glicólisis puede realizar funciones completamente distintas, ha complicado su comprensión. En los últimos años se ha realizado un gran esfuerzo para caracterizar, funcionalmente, las enzimas de las dos rutas glicolíticas de las plantas, mediante aproximaciones genéticas y moleculares. En esta tesis doctoral se ha caracterizado, funcionalmente, la familia de fosfoglicerato quinasas (PGK) de Arabidopsis thaliana, utilizando líneas con ganancia y pérdida de función. La gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa y la PGK son las dos únicas enzimas glicolíticas que también participan en el ciclo de Calvin-Benson, donde catalizan las reacciones reversas a las de la glicólisis, por lo que deben estar estrictamente reguladas. En las bases de datos de Arabidopsis encontramos tres genes que codifican para posibles isoformas de la PGK, At3g12780 (PGK1), At1g56190 (PGK2) y At1g79550 (PGK3). El estudio de la expresión génica de estas tres isoformas reveló que PGK1 se expresa fundamentalmente en tejido fotosintético mientras que PGK2 lo hace en tejido fotosintético y no fotosintético, aunque mayoritariamente en el primero. PGK3 se expresa, sin embargo, en todos los tejidos con aproximadamente igual intensidad. PGK1 y PGK2 son enzimas plastidiales, mientras que PGK3 se localiza en el citosol y núcleo. Todo lo anteriormente expuesto, junto con el análisis metabolómico y de actividad fotosintética de las distintas líneas indica que PGK1 es la isoforma fotosintética, mientras que PGK2 y PGK3 son las isoformas glicolíticas de los plastos y citosol, respectivamente. El estudio de los mutantes de las PGKs ha puesto de manifiesto que el metabolismo plastidial y citosólico están íntimamente conectados, entre sí y con otras rutas del metabolismo primario, y que existen mecanismos de regulación que tienden a mantener el equilibrio entre biosíntesis y degradación. Por último, la sobreexpresión de las isoformas plastidiales de las PGKs produce alteraciones del metabolismo del carbono y del nitrógeno que conducen a la inducción de una senescencia foliar precoz. Glycolysis became the first major metabolic pathway to be fully elucidated at the biochemical level in the 1940s. However, in plants, the existence of two different glycolytic pathways acting in parallel in the cytosol and plastids, along with the presence of several isoforms for each enzyme with probably different functions in heterotrophic and phototrophic cells has complicated its understanding. Over recent years, many efforts have been made to improve its understanding under genetic and molecular approaches. This works contributes to the functional characterization of the phosphoglycerate kinase family in Arabidopsis thaliana by a gain and loss of function approach. Glyceraldehyde 3-phospate dehydrogenase (GAPDH) and phosphoglycerate kinase (PGK) are the only enzymes of carbon metabolism catalyzing both forward and reverse reactions of photosynthesis and glycolysis in the same organelle. For this reason they should be highly regulated. In the Arabidopsis Information Resource database, we found three genes coding for three putative PGKs: At3g12780, PGK1; At1g56190, PGK2 y At1g79550, PGK3. Our studies reveal that PGK1 is expressed in photosynthetic tissues whereas PGK2 in photosynthetic and non-photosynthetic (heterotrophic) tissues, but mainly in photosynthetic. Finally, PGK3 have a constitutive expression across the whole plant. PGK1 and PGK2 are located in plastids while PGK3 is located in cytosol and nucleus. These results, along with photosynthetic measurements and metabolic profiling analyses suggest that PGK1 is involved in the photosynthesis, PGK2 in the plastidial glycolysis and PGK3 in the cytosolic glycolysis. By studying PGK mutants, we concluded that both plastidial and glycolytic pathways are intimately related to each other and to other primary metabolic pathways. In addition, we postulate that these pathways are highly regulated to keep the equilibrium between biosynthesis and degradation. Finally, our results suggest that overexpression of plastidial isoforms result in carbon and nitrogen metabolism changes which are responsible for early leaves senescence.