Desarrollo de ensayos citómicos de alto contenido y alto rendimiento para la predicción y clasificación del riesgo tóxico de compuestos químicos

Resumen

A raiz de la nueva política europea de limitar el uso de los ensayos clínicos en animales vertebrados para la detección y/o predicción de toxicidad humana, se han desarrollado nuevas estrategias para la realización de ensayos de toxicidad. Por ello, el desarrollo de métodos in vitro de análisis de citotoxicidad es una prioridad y ha conducido a la disponibilidad de técnicas relativamente sencillas con aceptable capacidad de detección de efectos in vitro y de predicción de toxicidad aguda in vivo. La citómica, como conjunto de tecnologías de análisis multiparamétrico de células individuales vivas en poblaciones complejas (citomas), se presenta en los últimos años como una gran alternativa para el estudio de citotoxicidad in vitro. Estudios previos de nuestro laboratorio en el contexto del proyecto europeo A-Cute-Tox, demostraban que un conjunto de ensayos citómicos in vitro, basados en la determinación de parámetros de citotoxicidad general y de estrés oxidativo en líneas celulares humanas, predecían mejor la toxicidad aguda humana de compuestos químicos que el ensayo clásico de citotoxicidad in vitro. Los ensayos lograban clasificar razonablemente los compuestos según su riesgo de toxicidad en una escala adaptada a los datos de toxicidad in vivo en humanos. Sin embargo, la comparación de los datos con el sistema internacional de clasificación (Global Harmonizing System, GHS), basado en los datos de toxicidad in vivo en rata, resultaba en una escasa capacidad de clasificación correcta. Estos resultados negativos limitan la utilidad de los ensayos citómicos con líneas humanas en el área de la Toxicología normativa y su integración en las estrategias de evaluación de riesgo tóxico de productos químicos. Esta Tesis Doctoral se basa en la hipótesis de que la transferencia a líneas celulares de rata de los ensayos citómicos con líneas humanas permitiría mejorar la capacidad de dichos ensayos in vitro para la clasificación del riesgo tóxico de compuestos químicos con el sistema GHS, basado en valores de toxicidad aguda de compuestos químicos en rata. Para demostrar la hipótesis de esta Tesis Doctoral, se han propuesto los siguientes objetivos metodológicos: 1. Poner a punto una plataforma de ensayos citómicos miniaturizados y de alto contenido para la determinación de parámetros generales de citotoxicidad y específicos de estrés oxidativo en tres líneas celulares de rata. 2. Validar la plataforma de ensayos citómicos mediante el análisis de compuestos de referencia (controles positivos) y la correlación de los valores de citotoxicidad (IC50, EC50) obtenidos en los ensayos citómicos, con los valores bibliográficos de citotoxicidad obtenidos en ensayos normativos in vitro e in vivo. 3. Determinar la capacidad de los ensayos citómicos de toxicidad in vitro para clasificar la toxicidad de compuestos químicos con el criterio del sistema global de armonización de la ONU (GHS), basado en la toxicidad in vivo en rata. 4. Cuantificar la capacidad de predicción y clasificación de la plataforma de ensayos mediante la determinación con técnicas estadísticas adecuadas del grado de asociación existente entre las variables que componen el modelo experimental. Los resultados muestran que: 1. La puesta a punto de un conjunto de ensayos citómicos miniaturizados y de alto contenido ha sido útil para la determinación de parámetros generales de citotoxicidad y específicos de estrés oxidativo en tres líneas celulares de rata, proporcionando un método rápido, sencillo y robusto. 2. Se ha validado la plataforma de ensayos citómicos in vitro diseñados, obteniendo buenas correlaciones para los valores de citotoxicidad y de estrés oxidativo ensayados, superiores a los valores bibliográficos in vitro basados en el test de captación de Rojo Neutro por células 3T3, así como en líneas celulares humanas empleadas previamente en nuestro laboratorio. 3. Aunque no se han obtenido resultados excesivamente satisfactorios, los ensayos citómicos clasifican correctamente la toxicidad de un gran número de compuestos químicos con el criterio del sistema global de armonización (GHS), basado en la toxicidad in vivo en rata. La capacidad de clasificación mejora respecto al método in vitro de referencia, basado en los valores de IC50 en el test de captación de Rojo Neutro por células 3T3. 4. Estadísticamente, el método propuesto proporciona una buena capacidad de predicción de los distintos parámetros ensayados, así como su grado de asociación dependiente de los mecanismos biológicos.