Análisis de psicoactivos en aguas, sedimentos y alimentosde la epidemiología de alcantarilla a la forensía medioambiental

Resumen

Las drogas de abuso tanto lícitas como ilícitas, los fármacos y los productos de higiene personal son contaminantes emergentes cuyo impacto para los ecosistemas es todavía escasamente conocido. En las últimas décadas ha habido un creciente interés en el estudio de estas sustancias debido a su elevado consumo y continua descarga en compartimentos medioambientales, tras su insuficiente eliminación en las estaciones depuradoras de aguas residuales (WWTPs). La naturaleza y cantidad de estos contaminantes están frecuentemente relacionados con las características, estado de salud y hábitos de las poblaciones que vierten a estas WWTPs. Por todo ello, el estudio de estos contaminantes tiene una doble vertiente: epidemiológicamente se pueden evaluar la magnitud, naturaleza y patrones de consumo a través del abanico de compuestos detectados en las WWTPs y ambientalmente se puede seguir el rastro y gestionar el peligro que estas sustancias representan para los ecosistemas. La epidemiología basada en el análisis de aguas residuales o también llamada epidemiología de alcantarilla constituye una herramienta importante para la estimación del consumo local a través de la investigación de los flujos de masa de drogas de abuso inalteradas o de sus metabolitos. La EMCCDA (European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction) reconoce este método como una alternativa a los métodos oficiales basados en entrevistas, datos médicos y estadísticas criminales para establecer el consumo de las drogas de abuso. Los efectos nocivos que el consumo de drogas tiene para la salud humana permiten predecir que la presencia de dichos compuestos en las aguas superficiales puede tener consecuencias toxicológicas sobre la flora y la biota acuáticas. Sin embargo, una de las herramientas, que todavía no se ha desarrollado suficientemente para abordar todos estos estudios, son las técnicas de determinación de estos compuestos en distintas matrices ambientales. A la complejidad de la matriz, se le unen las bajas concentraciones y la inestabilidad de estos compuestos, que hace difícil su determinación. Por todo ello, el Objetivo General propuesto se basa en el desarrollo de métodos analíticos más fiables para (i) determinar la presencia de las drogas estudiadas en diferentes matrices ambientales, (ii) para determinar los patrones de consumo de estas sustancias en Valencia y su área metropolitana, mediante la epidemiología de alcantarilla y (iii) para conocer las fuentes, niveles, transporte y destino de las mismas en el medioambiente aplicando estrategias de forensia medioambiental, teniendo en mente como fin último como podrían afectar al ser humano. Los Objetivos Específicos de la presente Tesis Doctoral se han concretado en los siguientes puntos: 1. Desarrollar metodologías analíticas selectivas y sensibles de identificación y cuantificación basadas en la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), y en la cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a la espectrometría de masas con un sistema híbrido de tipo cuadrupolo tiempo de vuelo (UHPLC-QqTOF-MS/MS) para determinar las sustancias seleccionadas. 2. Aplicar las metodologías desarrolladas en el análisis de aguas (influentes y efluentes de las WWTPs y aguas superficiales), sólidos en suspensión presentes en los influentes de las aguas residuales, lodos deshidratados elaborados en los tratamientos de las estaciones depuradoras y sedimentos depositados por las aguas superficiales. 3. Establecer los biomarcadores humanos capaces de estimar el tamaño poblacional a los que abastece cada WWTP que ofrezcan datos fiables y compararlos con los métodos tradicionales usados hasta el momento con este fin. 4. Determinar el consumo de drogas lícitas e ilícitas a nivel poblacional mediante el análisis de aguas residuales, a partir de la excreción de las drogas inalteradas o sus metabolitos. 5. Analizar la eficacia de las WWTPs en el tratamiento de las aguas residuales, según el grado de eliminación de determinadas drogas en los efluentes. 6. Comprobar la influencia y los efectos de la presión humana en una cuenca hidrográfica típica del área mediterránea a través de un estudio integrado de la contaminación de las aguas por drogas y su relación con otras características de calidad de las aguas. 7. Estimar la bio y fotodegradación y transformación de los estereoisómeros de una sustancia psicoactiva (fluoxetina) en diferentes matrices (aguas superficiales y lodos activos de estaciones depuradoras). 8. Evaluar la toxicidad de determinadas drogas a diferentes niveles tróficos mediante estudios in silico e in vivo. 9. Estimar otras posibles rutas de exposición humana a través de los alimentos y sus efectos potenciales en la población. Para desarrollar estos objetivos, se ha diseñado el siguiente Plan de Trabajo: En primer lugar, para definir con claridad los objetivos y establecer los aspectos limitantes de esta temática se ha realizado una revisión profunda de la literatura publicada hasta el momento, que nos ha permitido conocer los puntos fuertes y débiles para desarrollar un trabajo con perspectivas de futuro. Las drogas de abuso tanto lícitas como ilícitas se seleccionaron atendiendo a un consumo considerado como tradicional o por estar catalogadas como nuevas sustancia psicoactivas (NPS) —que incluyen tanto las ilegalizadas como las que aún no están sujetas a fiscalización internacional (conocidas como legal highs)— comercializadas a través de Internet. Asimismo, se seleccionaron ciertos fármacos y productos de higiene personal por su elevado interés como contaminantes emergentes. Seguidamente se diseñaron las campañas de muestreo en las WWTPs de Pinedo I, Pinedo II y Quart-Benáger (influentes, efluentes y lodos deshidratados) y en la cuenca del río Turia (aguas superficiales y sedimentos). Durante el trabajo realizado en la Universidad de Bath (Inglaterra) se diseñaron las campañas de muestreo de los lodos activos de la WWTP y las aguas superficiales del río Avon. Además, se seleccionaron diferentes alimentos que potencialmente podrían contener alguna de las sustancias objeto de estudio. Posteriormente se desarrollaron y validaron métodos analíticos para determinar las drogas tanto lícitas como ilícitas, los fármacos y productos de higiene personal seleccionados. Dichos métodos analíticos se basan en las siguientes técnicas: - Extracción en fase sólida (SPE), extracción sólido-líquido (SLE) y extracción asistida por ultrasonidos (UAE). - LC-MS/MS utilizando tanto un analizador triple cuadrupolo como un cuadrupolo tiempo de vuelo. Por último, los métodos desarrollados se aplicaron a las muestras de las matrices seleccionadas, en las que estos compuestos son susceptibles de ser transformados, mediante procesos de degradación, en un amplio abanico de sustancias desconocidas, incrementando la complejidad de su determinación. Para cerrar el ciclo de la contaminación medioambiental y de cómo pueden afectar estas drogas al ser humano, debemos considerar que muchas de ellas provienen de plantas naturales, y que además de su consumo intencionado pueden llegar al ser humano por otras vías. La presente Tesis Doctoral se ha estructurado en 5 capítulos. En cada uno de los capítulos se presentan las publicaciones científicas llevadas a cabo, las cuales presentan la misma estructura interna: introducción, materiales y métodos, resultados y discusión, conclusiones, referencias y material complementario. El Primer Capítulo presenta una introducción general, a través de una revisión bibliográfica, sobre el papel que tiene la espectrometría de masas como herramienta en la llamada epidemiología de alcantarilla. Esta revisión bibliográfica cubre tanto la estimación del consumo de drogas de abuso, como el análisis de las estimaciones poblacionales mediante biomarcadores, pasando por el estudio de los métodos de análisis no dirigidos para establecer el patrón de estas sustancias y sus productos de transformación. Además se establecen las perspectivas futuras de la espectrometría de masas en esta materia. Esta introducción se estructura como un artículo de revisión:  Publicación científica 1. Liquid chromatography-mass spectrometry as a tool for wastewater-based epidemiology (enviada) En el Capítulo 2 se detallan las metodologías analíticas desarrolladas y validadas para determinar las sustancias seleccionadas en diferentes matrices ambientales (aguas, lodos activos y sólidos en suspensión procedentes de WWTPs, y aguas superficiales y sedimentos procedentes de la cuenca del río Turia). Las metodologías desarrolladas basadas en el análisis LC-MS/MS y UHPLC-QqTOF-MS/MS se utilizaron para analizar los compuestos seleccionados. Los resultados obtenidos dentro de este capítulo se estructuran en tres publicaciones focalizadas en el desarrollo de métodos de identificación y análisis de estos compuestos.  Publicación científica 2. Simultaneous determination of traditional and emerging illicit drugs in sediments, sludges and particulate matter  Publicación científica 3. Analysis of psychoactive substances in water by information dependent acquisition on a hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometer  Publicación científica 4. Universal method to determine acidic licit and illicit drugs and personal care products in water by liquid chromatography quadrupole time-of-flight En el Capítulo 3 se aplican las metodologías desarrolladas en el capítulo anterior al análisis de las aguas procedentes de los influentes y efluentes de las WWTPs, para determinar la incidencia de las drogas de abuso, estimar su consumo en el área metropolitana de Valencia y establecer el rendimiento de eliminación de dichos compuestos en las principales WWTPs involucradas. Además se evalúa la toxicidad de determinadas drogas a diferentes niveles tróficos mediante estudios teóricos (ECOSAR). A partir de los datos obtenidos de los influentes se establece el consumo de drogas por parte de la población abastecida por dichas WWTPs, aplicando la epidemiología de alcantarilla. Asimismo se propone un método alternativo basado en el análisis de biomarcadores presentes en las aguas residuales para estimar dicha población. Este capítulo se ha estructurado en tres publicaciones científicas, las dos primeras focalizadas en la estimación de drogas y alcohol mientras que la tercera se centra en valorar los métodos para estimar la población servida por la WWTP, y donde se analizan, además de por los métodos clásicos, distintos biomarcadores recientemente propuestos como alternativas adecuadas para dicha estimación.  Publicación científica 5. Occurrence and removal of drugs of abuse in Wastewater Treatment Plants of Valencia (Spain)  Publicación científica 6. Estimation of alcohol consumption during “Fallas” festivity in the wastewater of Valencia city (Spain) using ethyl sulfate as a biomarker  Publicación científica 7. Estimating population size in wastewater-based epidemiology. Valencia metropolitan area as a case study. En el Capítulo 4 se abordan los problemas medioambientales suscitados por estos compuestos, mediante un estudio integrado de la contaminación generada. En este apartado se analizan números aspectos producidos a causa de esta contaminación. La relación entre la presencia de estos compuestos y las características de la población se establece mediante el uso de un Sistema de Información Geográfica (SIG). La relación entre los niveles de estos compuestos y los parámetros de calidad de estas aguas superficiales se determina mediante las correlaciones de Pearson. En este capítulo se presenta el trabajo llevado a cabo en la Universidad de Bath, en Inglaterra, durante un periodo en el cual se estimó la bio- y fotodegradación y la transformación enantioselectiva de un antidepresivo como es la fluoxetina en aguas superficiales del río Avon y lodos activos de la WWTP correspondiente a esa área. En este estudio también se evaluó la toxicidad de la fluoxetina a diferentes niveles tróficos mediante estudios in vivo. En la parte final del capítulo se evalúa el posible impacto en el ser humano debido al consumo de distintos productos alimenticios que pudieran contener cannabis o sus metabolitos. Este último problema, derivado de la alimentación del ganado con derivados del cáñamo, es un tema candente que ha preocupado a la European Food Safety Authority (EFSA), hasta el punto de destacar en un comunicado, la necesidad de estos estudios (EFSA 2011). El capítulo se organiza en tres publicaciones que cubren esta temática.  Publicación científica 8. Assessing drugs of abuse distribution in Turia River based on geographic information system and liquid chromatography mass spectrometry (enviada)  Publicación científica 9. Enantioselective transformation of fluoxetine in water and its ecotoxicological relevance (enviada)  Publicación científica 10. Analysis of cannabinoids by liquid chromatography-mass spectrometry in milk, liver and hemp seed to ensure food safety El Capítulo 5 tiene como objetivo aportar una visión global de los resultados y la discusión de la presente Tesis Doctoral. Por último, se recogen las conclusiones generales obtenidas y, a continuación, se incluyen diversos anexos en los que se encuentra la información complementaria (Índice de Tablas, Índice de Figuras, Índice de Abreviaturas). De acuerdo a los objetivos de la presente Tesis Doctoral, la investigación llevada a cabo y los resultados obtenidos, se puede concluir: Primero. La cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a la espectrometría de masas en tándem, utilizando un triple cuadrupolo, es selectiva, sensible, fiable y eficaz para la detección de las drogas de abuso seleccionadas en matrices complejas. Adicionalmente, los espectrómetros de masas de alta resolución, como el sistema híbrido cuadrupolo tiempo de vuelo, no sólo determinan las drogas seleccionadas, sino que también identifican un gran número de otros compuestos no seleccionados, metabolitos y productos de degradación presentes en muestras de aguas residuales y superficiales. Segundo. La aplicación de las metodologías analíticas desarrolladas muestra que, en los influentes de las estaciones depuradoras de aguas residuales, se detectaron concentraciones de ng L-1 para la mayoría de los compuestos, aunque en casos como la benzoilecgonina, la cocaína y el etil sulfato se alcanzan valores de μg L-1. En los efluentes y en las aguas superficiales del río Turia se detectan menos drogas y a más bajas concentraciones que en los influentes. Los sólidos en suspensión y los lodos deshidratados de las estaciones depuradoras contienen compuestos cocaínicos y opiáceos a concentraciones de ng g-1. Tercero. Entre los biomarcadores humanos específicos, las estimaciones de la población realizadas con las cargas diarias de cafeína, cotinina, y en una estación depuradora también con el ácido 5-hidroxiindolacético fueron las más precisas y comparables respecto a los datos del censo y los parámetros hidroquímicos. El uso de biomarcadores para estimar la población debe ser evaluado con precaución, ya que en casos especiales como la presencia de fábricas de embotellado de bebidas de cola, pueden distorsionar los resultados obtenidos a partir del uso de la cafeína como biomarcador. Sin embargo, pueden ser una herramienta invaluable para reducir la incertidumbre en el tamaño de la población servida por las estaciones depuradoras de aguas residuales. Cuarto. La aplicación de la epidemiología de alcantarilla en el estudio realizado durante varios años en tres estaciones depuradoras que abastecen a Valencia y su área metropolitana, muestra que las drogas más consumidas son cannabis y cocaína seguidos de ketamina, anfetamina, metanfetamina y éxtasis. Además, pone de manifiesto que el consumo de alcohol durante la festividad de las Fallas se incrementa hasta un 400 por ciento respecto a una semana considerada normal. Quinto. Las drogas seleccionadas son eliminadas en las estaciones depuradoras con una eficacia superior al 95%, excepto el éxtasis y la ketamina que son recalcitrantes y apenas se eliminan. Los resultados obtenidos muestran que la eficacia de eliminación varía ligeramente según el tratamiento de las depuradoras. Pinedo II, con tratamiento terciario, muestra una mayor eliminación de las drogas seleccionadas que las depuradoras sin este tratamiento como Pinedo I y Quart-Benáger. Sin embargo, para los compuestos recalcitrantes sería conveniente buscar tratamientos alternativos. Sexto. Existe una gran dificultad para establecer la relación entre las concentraciones de las drogas de abuso en el medioambiente y la presión humana en la cuenca del río Turia, debido a la presencia esporádica, el carácter pseudopersistente y la compleja degradación de estos compuestos. Sin embargo, la aplicación del Sistema de Información Geográfica, muestra cualitativamente que la presencia de estos contaminantes está ligada a grandes poblaciones con más de 10000 habitantes. Séptimo. Los microcosmos que simulan el río revelan que la degradación de la fluoxetina se lleva a cabo a través de procesos fotoquímicos y microbianos, siendo los fotoquímicos los más significativos. Los procesos microbianos en aguas superficiales muestran una ligera enantioselectividad favoreciendo la persistencia del enantiómero (R). En lodos activos donde se estudiaron los procesos metabólicos microbianos, se observó una estereoselectividad pronunciada que favoreció la degradación de la (S)-fluoxetina y la formación de (S)-norfluoxetina. Estos resultados ponen de manifiesto la importancia del estudio quiral de los enantiómeros. Octavo. Los cocientes de riesgo calculados a tres niveles tróficos para las drogas de abuso detectadas en los efluentes de las depuradoras índica un riesgo agudo medio para el éxtasis, bajo para la ketamina y sin riesgo para la benzoilecgonina. Los estudios in vivo de toxicidad aguda realizados para los enantiómeros de la fluoxetina y la norfluoxetina en organismos acuáticos, indican que no existe enantioselectividad en la respuesta tóxica de Daphnia magna pero sí que se observa en el caso de Tetrahymena thermophila, siendo 30 veces superior la toxicidad de la (R)-fluoxetina que la del enantiómero (S). Las concentraciones de compuestos detectados en el río Turia no suponen un riesgo. Las drogas de abuso son pseudopersistentes y están sujetas a fenómenos de degradación complejos en el medioambiente, por lo que una exposición crónica a estos compuestos podría producir efectos a largo plazo. Noveno. Los estudios realizados para evaluar rutas de exposición alternativa a los derivados del cannabis a través de los alimentos demuestran que, el contenido de tetrahidrocannabinol en las semillas de cáñamo utilizadas como pienso para animales es inferior al marcado por la EFSA. El tetrahidrocannabinol se detecta en fórmulas de crecimiento en concentraciones de ng L-1, pero no se detecta en otros tipos de leche, ni en hígados de vaca. No se detectan metabolitos del tetrahidrocannabinol en ninguna de las matrices alimentarias analizadas. Aunque las concentraciones detectadas no presentan peligro para los seres humanos, el método analítico desarrollado puede ser una piedra angular para garantizar la inocuidad de los alimentos. ______________________________________________________________________ Referencias EFSA (2011). "European Food and Safety Authority. Scientific Opinion on the safety of hemp (Cannabis genus) for use as animal feed." EFSA J 9(3): 0-41. Available on-line: www.efsa.europa.eu/efsajournal.