Funció de membres de la família de transportadors copt en l'homeòstasi del coure d'Arabidopsis Thalina

Abstract

El coure (Cu) és un element essencial per tal de dur a terme les reaccions de transferència d’electrons en els organismes de metabolisme aerobi. Tanmateix, la citotoxicitat associada a l’excés de Cu, deguda a la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS), implica l’existència de mecanismes homeostàtics regulats de forma precisa. La majoria dels elements de la xarxa homeostàtica del Cu està conservada en els organismes eucariotes. Els transportadors de Cu d’alta afinitat CTR/COPT hi participen durant el procés d’adquisició del metall sota condicions de deficiència. En la present tesi s’escomet l’establiment dels rangs nutricionals de Cu i la identificació de marcadors moleculars associats en la planta model Arabidopsis thaliana. En base als resultats obtesos, se suggereix que els medis ½MS suplementats amb una concentració entre 0.5 i 1 ?M de CuSO4 comprenen el rang de suficiència de Cu. Per altra banda, l’excés de Cu s’associa als medis suplementats amb una concentració igual o superior a 5 ?M CuSO4, mentre que la deficiència de Cu s’estableix en els medis suplementats amb una concentració inferior a 0.5 ?M de CuSO4. El patró d’expressió dels mRNA regulats per Cu suggereix que COPT2 i FSD1 esdevenen marcadors moleculars per detectar el dèficit de Cu, mentre que l’expressió de CCS i CSD1 s’associa a rangs òptims. Atenent a aquests paràmetres, s’ha aportat noves evidències de què el medi ½ MS comercial, considerat un medi estàndard per créixer plantes, esdevé un medi deficient en Cu. En segon lloc, s’ha abordat la caracterització de les proteïnes COPT2, COPT6 i COPT5 d’Arabidopsis thaliana. Podem concloure que COPT2 i COPT6 constitueixen, junt amb COPT1, els transportadors de membrana plasmàtica. Ara bé, mentre que sota condicions de deficiència de Cu COPT1 i COPT2 s’expressen fonamentalment a l’arrel principal amb un patró no solapant, COPT6 és un gen d’expressió exclusiva a la part aèria, els nivells del qual no s’alteren per Cu. La importància del Cu en la planta es reflecteix en què tots tres transportadors de membrana plasmàtica s’expressen a l’embrió i als teixits reproductius, i s’evidencia pels fenotips dels mutants per pèrdua de funció. Tot i que els mutants de pèrdua d’expressió copt2 no exhibeixen alteracions en deficiència de Cu, els mutants COPT1 antisentit manifestaven una disminució en el contingut de Cu endogen i alteracions morfològiques en el gra de pol•len, mentre que la línia mutant copt6 produeix menys llavors que les línies silvestres en condicions de dèficit de Cu. COPT5, per la seua banda, esdevé un transportador intracel•lular probablement associat al compartiment prevacuolar (PVC) d’expressió àmplia en el cos de la planta, a excepció de les anteres i del gra de pol•len, preferentment a nivell de feixos vasculars i nervadures. La manca d’expressió de COPT5 en els mutants per pèrdua de funció causa una hipersensibilitat al dèficit sever de Cu que es tradueix en la inhibició del creixement de l’arrel principal, pèrdua de pes fresc i un estat avançat de clorosi. De la mateixa manera, el dèficit sever de Cu implica en els mutants copt5 una disminució dràstica en el flux de la cadena de transport d’electrons entre fotosistemes, probablement degut a alteracions en la distribució del Cu a la plastocianina. Tot plegat, COPT5 constitueix una via essencial per a la distribució del Cu en condicions de dèficit sever i perllongat de Cu. Les dades aportades en la present tesi doctoral contribueixen a millorar el coneixement de la resposta d’Arabidopsis thaliana al dèficit de Cu i bastiran el desenvolupament de futures estratègies biotecnològiques enfocades tant a la millora de l’adquisició del Cu com a la fitorremediació. Copper (Cu) is an essential element that participates in electron transfer reactions in aerobic organisms. Nevertheless, Cu excess causes toxicity among others reasons due to reactive oxygen species generation. Eukaryotic cells display conserved homeostatic networks in which the CTR/COPT proteins are involved in high affinity Cu uptake under environmental deficient conditions. In this thesis, we have first studied the availability of Cu in the Arabidopsis thaliana growth medium ½MS. We show that the ½MS medium supplemented with 0.5-1 ?M CuSO4 represents the Cu sufficiency range, whereas Cu excess is achieved in media with more than 5 ?M CuSO4 and Cu deficiency results from growth in media with a concentration of CuSO4 bellow 0.5 ?M. Furthermore, gene expression studies at different Cu concentrations suggest that COPT2 and FSD1 are appropriate markers for Cu deficiency in Arabidopsis. We have also characterized the role played by COPT2, COPT6 and COPT5 in Arabidopsis. According to the expression studies performed with COPT::GFP fusion constructs, COPT2 and COPT6 are plasma membrane proteins. By using COPTp::GUS plants, we show that COPT2 is a Cu-regulated gene, mostly expressed in roots, whereas COPT6 is predominantly expressed in aerial tissues in a Cu-independent manner. Interestingly, our studies demonstrate that Arabidopsis COPT5 is a protein associated to the prevacuolar compartment and expressed through the whole plant, except in anthers and pollen grains. Moreover, copt5 knock-out lines are hypersensitive to Cu deficiency and exhibit an inhibition of the main root growth and a decrease in both fresh weight and chlorophyll when compared to the wild type. Furthermore, Cu deficiency causes the impairment of copt5 electron transport between photosystems, probably due to problems in Cu delivery to plastocyanin. Altogether, these data suggest that COPT5 functioning is crucial for Cu delivery under severe Cu deficiency conditions.