Análisis transcriptómico del daño por frío en fruto de melocotón

Resumen

En la industria hortofrutícola las bajas temperaturas se utilizan para retrasar la maduración y el decaimiento de los frutos. A pesar de tener un uso extendido, los frutos de melocotón sometidos a almacenamiento prolongado en frío (CS) a menudo desarrollan una forma de daño por frío (CI) genéticamente controlada llamada harinosidad (mealiness/woolliness [WLT]): un desorden textural de la pulpa del fruto caracterizado por la perdida de suculencia Aunque durante el frío se han observado algunas alteraciones microscópicas, los síntomas visibles o macroscópicos de daño se desarrollan, no obstante, cuando los frutos se transfieren a temperatura ambiente (temperaturas de simulación de vida útil, SLR) para inducir la maduración después del almacenamiento. Con el objetivo de analizar los mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo de la harinosidad durante el almacenamiento en frío (estadio pre-sintomático) y maduración en condiciones de simulación (estadio sintomático), diversos estudios transcriptómicos y proteómicos se han realizado. Estos estudios han resultado en la identificación de diferentes funciones celulares probablemente importantes para el desarrollo de los síntomas de la harinosidad, aunque no profundizan en el análisis y algunos resultados son aparentemente contradictorios (ya que en ellos se usan diferentes variedades de melocotón y protocolos de CS/SLR). Para proporcionar una visión más comprehensiva del desorden de la harinosidad en esta tesis se ha utilizado una aproximación genómica-genética que consiste en la combinación de grupos de líneas hermanas de la población de melocotón Pop-DG (con sensibilidad contrastante para desarrollar harinosidad) con una micromatriz de cDNA (Chillpeach microarray) dedicada al daño por frío para perfilar la expresión génica. Esta estrategia nos ha permitido identificar un gran número de genes asociados a la sensibilidad/tolerancia a desarrollar la harinosidad tanto a en estadios pre-sintomático (fruto maduro y CS) como sintomático, mientras que se compensan otras diferencias fenotípicas que segregan al azar en la población. Mediante la el análisis Fluidigm RT PCR, que se podría definir como qRT-PCR de media capacidad, hemos confirmado la validez de esos marcadores de expresión en los grupos de líneas hermanas, pero más importante, estos marcadores de expresión han resultado ser validos y reproducibles en lineas hermanas individuales de la población Pop-DG y en otros genotipos de melocotón (Oded y Hermoza) con diferentes grados de tolerancia al daño por frío. Además los perfiles de expresión de Od, Hz y los dos grupos de la población Pop-DG se han analizado también con la herramienta bioinformática ROSMETER, que proporciona información de la especificidad de la respuesta transcriptómica al estrés oxidativo. La anotación funcional de los genes diferencialmente expresados nos ha permitido proponer algunas hipótesis sobre los procesos moleculares que ocurren en el fruto de melocotón mientras está almacenado a 5ºC y cuando, posteriormente se deja madurar a temperatura ambiente, que extienden nuestra hipótesis de trabajo sobre el desorden de la harinosidad más allá de los cambios en la pared celular. Low temperatures are commonly used in the horticultural industry to delay peach ripening s and fruit decay. Despite widespread use, peach fruits subjected to prolonged cold storage (CS) periods often develop a genetically controlled form of chilling injury (CI) called mealiness/woolliness (WLT): a flesh textural disorder characterized by a lack of juiciness. Although some microscopic alterations had been observed during CS, visual symptoms (or macroscopic) of WLT appeared however upon transferring the fruits to the room temperature conditions (shelf life ripening [SLR] temperatures,) that are used for inducing ripening after CS. To dissect the molecular mechanisms underlying the WLT development during CS (pre-symptomatic stage) and SLR (symptomatic stage), several transcriptomic and proteomic studies have been reported. These studies have resulted in the identification of different cellular functions as important for the development of the WLT but they did not go deep in the analysis and some results were apparently contradictory (as they used different peach varieties and CS/SLR protocols). To give a more comprehensive view of WLT disorder we have used a genetical genomic approach consisting in the combination of pools of siblings of the Pop-DG population, with contrasting sensitivity to develop WLT, with a CI-dedicated Chillpeach microarray to profile gene expression. This strategy have enable us to identify a large number of genes associated to the sensitivity /tolerance to develop WLT both at pre-symptomatic (mature and CS) and symptomatic (SLR) stages, while compensating for other phenotypic differences randomly segregating in the population. By medium throughput qRT PCR analysis we confirmed the validity of these gene expression markers in the pools, but most important, there were proved to be reliable in individual siblings of the Pop-DG population and other peach genotypes (Oded and Hermoza) with different tolerance degree to chilling injury. Further the expression profiles of Oded, Hermoza and of the two pools from the Pop?DG population were also analyzed with the bioinformatic tool ROSMETER that provides information on the specificity of the transcriptomic response to oxidative stress. Functional annotation of genes differentially expressed has enabled us to propose some hypotheses of the molecular processes occurring in the peach fruit while stored at 5ºC and later when let to ripen at room temperature that extends our working hypothesis about WLT disorder beyond the cell wall changes