Variability and host-dependency of RNA virus mutation rates

Resumen

Los virus de ARN pueden infectar todo tipo de organismos, desde los procariotas a los eucariotas superiores, y estos agentes infecciosos parecen particularmente propensos a causar enfermedades emergentes tanto en humanos, animales, como en plantas. Su habilidad para escapar del sistema inmunitario, evadir estrategias antivirales o infectar a nuevas especies son aspecto más de su rápida evolución. Por lo tanto, comprender los procesos básicos del la evolución de los virus de ARN podría ayudar en el diseño de nuevas estrategias antivirales. Una de las principales características de los virus de ARN es su tasa de mutación extremadamente alta. De hecho, la alta diversidad genética de las poblaciones virales da lugar a una nube de variantes que interactúan y contribuyen colectivamente, conocido también por el término de cuasiespecies, y que permite a las poblaciones virales adaptarse rápidamente a entornos dinámicos. Estudios anteriores han demostrado que la tasa de mutaciones espontáneas de los virus de ARN varía de 10-6 a 10-4 sustituciones por nucleótido por célula infectada (s/n/c) y puede variar considerablemente, incluso para el mismo virus, aunque se sabe poco sobre las causas de esta variabilidad. Consecuentemente, el conocimiento de la tasa de mutación y el espectro molecular de mutaciones espontáneas son importantes para entender la evolución de la composición genética de las poblaciones virales. En los virus de ARN las tasas de mutación están determinadas por factores codificados por el virus, como la fidelidad de la polimerasa viral, la presencia/ausencia de mecanismos correctores, o el modo de replicación viral. Sin embargo, sólo unos pocos estudios se han centrado en las características celulares que podrían explicar la variabilidad en la producción de la diversidad genética viral, o si esta variabilidad pudiera ser distribuida heterogéneamente entre células únicas. En este estudio, se propuso analizar algunos de los factores subyacentes a la variabilidad en las tasas de mutación de los virus de ARN. En primer lugar, se estudió el efecto del tipo de célula que se infecta, y la variación en función del huésped en el que el virus se replica. A continuación, nos centramos en la variabilidad que ocurre a nivel de una célula única, mediante la caracterización de la diversidad genética de los virus liberados a partir de células individuales. Por último, nos fijamos en el potencial efecto de factores celulares de tipo ADAR, mediante la determinación del tipo de mutaciones espontáneas que se acumulan en el genoma de un norovirus. Se utilizó la prueba de fluctuación de Luria-Delbrück para comprobar la variabilidad en la tasa de mutación del virus de la estomatitis vesicular (VSV) entre diferentes células de mamíferos, así como entre diferentes condiciones de cultivo. Se encontró una tasa de mutación similar entre las células BHK-21, así como en células embrionarias de ratón (MEF), células MEF inmortalizadas mediante deleción del gen p53, células de cáncer de colon murino (CT26) y de neuroblastoma (Neuro-2A), sugiriendo que VSV se replica con la misma fidelidad en estos diferentes tipos de células de mamíferos. Por otra parte, debido a que el ciclo de vida de VSV no sólo implica su replicación en mamíferos, sino también en insectos, comprobamos su tasa de mutación en células de Drosophila melanogaster (S2), de Spodoptera frugiperda (sf21) y del mosquito Aedes albopictus (C6/36). Curiosamente, la tasa de mutación de VSV fue cuatro veces mas baja en células de insectos en comparación con las células de mamíferos probadas. Curiosamente, los arbovirus parecen tener una evolución más lenta que los virus que no estan transmitidos por un vector, y nuestros resultados sugieren que en los insectos esto puede ser en parte debido a una tasa de mutación más baja. Se desarrolló un enfoque que combina micromanipulación y secuenciación masiva para estudiar la diversidad genética de los virus producidos y liberados por células únicas, usando de nuevo VSV como sistema modelo. Demostramos que el virus presenta gran diversidad genética en células únicas, aunque esta diversidad no fue homogéneamente contribuida por todas las células. Llama la atención que la variabilidad existente en el inóculo viral demostró que la unidad infecciosa mínima (PFU) también puede transmitir diversidad genética viral. En efecto, no sólo se observó complementación genética entre alelos de las variantes albergadas dentro de la misma PFU, sino también que el efecto de una mutación se determinó colectivamente por otras variantes durante su co-transmisión, un proceso que podría seguir durante varias generaciones. Esta co-transmisión de diversidad genética dentro de la misma unidad infecciosa tiene implicaciones importantes para la evolución viral, como por ejemplo la de mantener la diversidad genética durante fuertes cuellos de botella de las poblaciones virales, o crear una asociación espacial entre los alelos, y sugiere que la selección natural actúa a nivel de conjuntos de partículas virales diversas en lugar de sobre genotipos individuales. Por último, hemos visto que la variabilidad en la diversidad genética producida entre células únicas estaba estrechamente asociada con el rendimiento viral, sugiriendo un compromiso entre la eficacia y la fidelidad de la replicación del virus, que puede ser determinado por un modelo de replicación geométrica. Aunque este tipo de replicación alimenta la aparición de nuevas mutaciones, también aumenta la carga genética. Para equilibrar ambos mecanismos, hemos demostrado que los mutantes que muestran un fenotipo mutador deberían ser encontrados en una baja frecuencia en las poblaciones virales. Se usó un clon infeccioso del virus Norwalk (NV). Puesto que NV no es capaz de iniciar subsiguientes ciclos de infección en las células aquí utilizadas (HEK293T), tuvimos la posibilidad de observar la aparición de mutaciones espontáneas en un único ciclo, descartando así posibles efectos de la selección o la acumulación de mutaciones a lo largo de varias generaciones. Obtuvimos así una tasa de mutación de 9 × 10-5 s/n/c consistente con las estimaciones publicadas anteriormente para otros virus de ARN. Curiosamente, se observó que de los 128 clones moleculares secuenciados con el Sanger, dos mostraron múltiples cambios T -> C. Sugerimos que estas hipermutaciones podrían ser el resultado de la edición del RNA viral por parte de enzimas celulares de tipo ADAR. Esta hipótesis fue confirmada por secuenciación masiva, sugiriendo que los factores celulares de tipo ADAR también pueden actuar en la variabilidad de la tasa de mutación de los virus de ARN.