Nonapeptidergic systems in the brain of the mousemapping the distribution of vasopressin and oxytocin in the social and maternal brain

Resumen

1. INTRODUCCIÓN 1.1. El comportamiento social El comportamiento social se define como el conjunto de interacciones que ocurren entre dos o más individuos de una misma especie. Presumiblemente, los comportamientos sociales evolucionaron al suponer una ventaja selectiva para los individuos que los practicaban. Por ejemplo, interacciones cooperativas pueden ayudar en la búsqueda de alimento, incrementar la protección contra depredadores o facilitar los desplazamientos y la cría. Las especies sociales pueden clasificarse como eusociales o presociales. La eusocialidad corresponde al grado más alto de organización social y se encuentra en numerosas especies de Himenópteros (hormigas, abejas, avispas) e Isópteros (termitas), pero también en dos especies de roedores llamadas "ratas topo" (Heterocephalus glaber and Fukomys damarensis) (O'Riain & Faulkes, 2008; Wilson & Hölldobler, 2005). Con menor grado de organización social, los animales presociales pueden dividirse en: subsociales, solitarios pero sociales y parasociales (que incluye comunales y semisociales). Esta clasificación fue ideada por Michener (1969) para insectos, pero es ampliamente utilizada en otros taxones animales. De hecho, el comportamiento social aparece en gran variedad de especies animales, incluyendo invertebrados, peces, pájaros y mamíferos. Dentro de una misma especie, los comportamientos sociales pueden tener varios propósitos y generalmente se clasifican como agonísticos (competitivos), afiliativos, sexuales o parentales. Durante largo tiempo, el comportamiento social ha resultado demasiado complicado para ser estudiado mediante aproximaciones mecanicistas. En la actualidad, los avances técnicos en neurociencia y el uso de modelos animales adecuados están revelando las redes neurales implicadas sus conexiones y su neuroquímica. Estos circuitos están sujetos a regulaciones fisiológicas internas y a la influencia de estímulos sensoriales externos. Si embargo, gran parte de los comportamientoa socio-sexual aparecen de forma innata, lo que indica que la circuitería subyacente está codificada en el genoma, lo que facilitaría su estudio. Uno de los modelos animales por excelencia para la investigación neurocientífica es el ratón (Mus musculus). Igual que muchos otros roedores, tiene una compleja vida social que depende del reconocimiento de otros conespecíficos y la correcta identificación de su género, edad, estado hormonal y estatus. Al igual que otros animales macrosmáticos, los ratones obtienen la mayor parte de esta información a través del uso de señales químicas. De esta forma, su vida social está guiada por el olfato y la vomerolfacción, de igual manera que la interacción social en humanos depende principalmente de información visual y auditiva. En el caso de los ratones, se ha demostrado que algunas señales químicas producidas por un individuo pueden desencadenar respuestas estereotipadas en otros individuos, ajustándose por tanto a la definición clásica de feromona (Karlson & Luscher, 1959). En trabajos previos, nuestro grupo se ha dedicado a identificar la naturaleza olfativa o vomeronasal de las feromonas que median la atracción sexual en ratones y los circuitos cerebrales que median su efecto. Los primeros estudios indicaron que las excreciones y secreciones de los machos resultan innatamente atractivas para las hembras (Moncho-Bogani et al. 2002). Estas supuestas feromonas actuan como estímulo reforzante como lo demuestran experimentos de inducción de preferencia de lugar condicionada (Martinez-Ricos et al., 2007). Además, las lesiones del bulbo olfatorio accesorio eliminan tanto la atracción como la preferencia de lugar, demostrando que estas posibles feromonas son detectadas por el sistema vomeronasal (Martinez-Ricos et al., 2008). Trabajos más recientes han conseguido identificar algunas de estas feromonas. Por ejemplo, se ha identificado un péptido en la secreción lacrimal de los machos que induce receptividad en las hembras (Haga et al., 2010), y una proteína urinaria responsable de la atracción femenina hacia los machos (MUP-20 o darcina, Roberts et al. 2010) que también induce preferencia condicionada de lugar (Roberts et al, 2012). Nuestro grupo ha demostrado que la darcina promueve la agresión maternal en hembras lactantes (Martín-Sánchez et al, 2015), lo que contrasta con sus propiedades atractivas en las mismas hembras en otros períodos de su ciclo vital (por ejemplo en vírgenes). De forma similar, las proteínas urinarias son responsables de la agresión entre machos (Chamero et al., 2007). En conjunto, estos datos indican que las señales químicas juegan un papel clave en la modulación del comportamiento social en ratón, y sugieren que los núcleos cerebrales que procesan la información olfativa y vomeronasal forman parte de la red neural que controla el comportamiento social, como discutimos a continuación. 1.2. El cerebro socio-sexual y la amígdala El comportamiento social está dirigido por un sistema cerebral específico, la red cerebral socio-sexual (socio-sexual brain network, SBN) compuesta por seis nodos, según lo propuesto originalmente por Newman (1999; Fig. A). Cada nodo de la SBN ha de cumplir tres criterios: estar implicado en el control de más de un comportamiento social, estar recíprocamente interconectado con los demás nodos y contener receptores para esteroides sexuales. Otras áreas cerebrales también son importantes para el control del comportamiento social, y la SBN debería entenderse como el "núcleo" de la red que controla dichos comportamientos. En lugar de tratarse de un circuito lineal, la SBN constituye una red en la que cada nodo responde una gran variedad de estímulos y la respuesta comportamental resultante está asociada con un determinado patrón de actividad de los nodos que componen la red (Fig. A). El modelo tiene sus limitaciones, pero se apoya en gran cantidad de evidencia experimental. Además, de acuerdo con su importancia adaptativa, se encuentra muy conservado, estando presente en todos los vertebrados estudiados (Goodson, 2005). Fig. A. La red neural socio-sexual (socio-sexual brain network, SBN), según Newman (1999), adaptado del artículo original. La red está compuesta por seis nodos: la amígdala medial extendida (MeEA), septum lateral (LS), área preóptica medial (MPOA), hipotálamo anterior (AH), hipotálamo ventromedial (VMH) y núcleos mesencefálicos (Mid). Arriba, representaciones esquemáticas de datos de genes de expresión temprana muestran dos patrones de activación diferentes en dos situaciones comportamentales. En el caso de los roedores, la modulación de comportamiento social por estímulos quimio-sensoriales se produce a través de inputs directos e indirectos a la SBN, principalmente a la amígdala. La amígdala medial extendida (MeEA, Fig. A) contiene gran cantidad de receptores para hormonas esteroideas (Mitra et al., 2003; Simerly et al., 1990), además de los centros vomeronasales secundarios y muchos olfativos secundarios y terciarios (Martínez-García et al., 2012). Junto con otras áreas amigdalinas como la amígdala cortical posteromedial, que constituye la corteza vomeronasal (Gutiérrez-Castellanos et al., 2014), la MeEA envía proyecciones a una región específica de la porción medial del estriado-pálido ventral (mvStP; Ubeda-Banon et al. 2008; Novejarque et al. 2011; Pardo-Bellver et al. 2012). Este hecho resulta muy relevante, ya que el estriado ventral es una región clave para el control de comportamientos motivados. El input directo desde la amígdala quimiosensorial, sugiere que el estriado-pálido ventral puede incluir una región para el control de los comportamientos motivados por feromonas, que sería crucial para el control de interacciones intraespecíficas como decidir entre atacar, expresar comportamientos afiliativos, parentales o sexuales. De hecho, esa región es fundamental para la formación de lazos de pareja en topillos (Larry J Young & Wang, 2004), y trabajos independientes en diversos laboratorios, incluido el nuestro, han mostrado que la lesión del mvStP elimina el valor reforzante de las feromonas sexuales en ratones (Agustin-Pavon et al., 2014; DiBenedictis et al., 2014). Dado que el comportamiento socio-sexual difiere entre machos y hembras, la red neural que controla dichos comportamientos, el SBN, también muestra diferencias entre sexos. Estas diferencias están gobernadas por esteroides sexuales, también en la edad adulta. No es de extrañar, pues, la abundancia de receptores de hormonas esteroideas en el SNB. 1.3. Los nonapéptidos y la regulación del comportamiento social Además de la expresión de receptores sexuales y conectividad recíproca, las áreas que componen el SBN poseen otra característica distintiva: una abundante inervación nonapeptidérgica y la expresión de receptores para nonapéptidos. Los roedores y otros mamíferos (incluyendo los humanos) expresan dos nonapéptidos estrechamente emparentados, la arginina-vasopresina (AVP) y la oxitocina (OT). De sus nueve aminoácidos la AVP y OT difieren únicamente en la tercera y octava posición. La evidencia indica que la AVP y la OT proceden de la duplicación génica de un ancestro común, poco antes de la divergencia evolutiva de los vertebrados (H. Caldwell & Young 3rd, 2006). El péptido ancestral puede encontrarse en especies tan distantes como moluscos y anélidos, y su función está altamente conservada, cumpliendo roles similares en las respectivas especies (Choleris et al., 2013). Ambos nonapéptidos son sintetizados en forma de péptido precursor, que es almacenado en vesículas y procesado dentro de las mismas. Las respectivas prohormonas son cortadas dando lugar a la forma madura de AVP y OT, sus proteínas transportadoras (neurofisina-I y neurofisina-II respectivamente) y péptidos residuales. De esta forma, las neurofisinas I y II son almacenadas y liberadas junto a sus correspondientes nonapéptidos (Burbach et al. 2001). En roedores y humanos se han identificado cuatro receptores para nonapéptidos: V1aR, V1bR, V2R y OTR). Los más abundantes en el sistema nervioso central son el V1aR y OTR, mientras que el V1bR se expresa en unas pocas regiones cerebrales y el V2R está prácticamente restringido a tejidos periféricos (Gimpl et al., 2001; Verbalis, 2010). Todos estos receptores pertenecen a la familia de receptores acoplados a proteína G y su activación tiene efectos sobre canales iónicos, movilización de calcio y regulación de la expresión génica entre otros (ver Stoop, 2012). Es importante tener en cuenta la elevada promiscuidad de los receptores para nonapéptidos. A pesar de lo que sus nombres sugieren, la AVP puede unirse al OTR y a los V1Rs con similar afinidad. La OT es más específica, aunque puede unirse a los V1Rs con una afinidad cien veces menor que al OTR (Manning et al., 2012). En el sistema nervioso central, la activación de V1aR y OTR por AVP y OT parece implicada en el control de comportamientos sociales y no sociales, así como funciones reproductivas, incluyendo olfacción y procesamiento sensorial, miedo y ansiedad, estrés y homeostasis, y aprendizaje y memoria (Carter et al., 2008; Donaldson & Young, 2008; Meyer-Lindenberg et al., 2011; Neumann & Landgraf, 2012; Stoop, 2012). Además la expresión de nonapéptidos y sus receptores en la SNB sugiere un papel importante en el control de las funciones sociales mediadas por estímulos olfativos, como el reconocimiento social (Ferguson et al. 2001; Bielsky et al. 2005) y la agresión y motivación social (S. R. Wersinger et al., 2007; Scott R. Wersinger et al., 2004). En una excelente revisión, Thomas Insel (2010) explica la relación entre la expresión de receptores para nonapéptidos en el estriado ventral y los lazos afectivos. Un caso muy conocido es el de algunas especies de topillos, en las que los vínculos afectivos de pareja dependen de la expresión del V1aR en el estriado-pálido ventral (M M Lim & Young, 2004). Este hecho pone de manifiesto la relevancia de las proyecciones desde la amígdala vomeronasal al mvStP en las interacciones sociales. También se ha visto que variaciones genéticas en el locus del receptor V1a (AVP1RA) se relacionan con diferencias en el comportamiento socio-sexual en topillos (E. A. D. Hammock & Young, 2005) y en humanos (Israel et al., 2009; Prichard et al., 2007), llegando a asociarse con la aparición de trastornos autistas (Kim et al., 2002; Wassink et al., 2004). La mayor parte de estudios en humanos utilizan la administración intra-nasal de oxitocina y, en menor medida, de vasopresina. Aunque no se ha demostrado que puedan atravesar la barrera hemato-encefálica, la OT parece tener efectos pro-sociales (Kosfeld et al. 2005; Domes et al. 2007), mientras que la AVP tiene efectos sexualmente dimórficos, pro-sociales en mujeres y agonísticos en hombres (Thompson et al., 2006). 1.4. Sistemas nonapeptidérgicos centrales: neuromodulación compleja de funciones complejas La oxitocina y vasopresina tienen un papel dual, actuando como neurotransmisores centrales y como neurohormonas periféricas. Sintetizadas en los grupos magnocelulares del hipotálamo, son secretadas a sangre, donde la OT promueve la contracción uterina durante el parto y la eyección de leche durante la lactancia, mientras que la AVP tiene efectos vasopresores y antidiuréticos. En el sistema nervioso central, existen células e inervación nonapeptidérgica fuera del hipotálamo, y tanto AVP como OT pueden ser liberados desde los axones, dendritas y somas neuronales (Ludwig & Leng, 2006; Sabatier et al., 2004; Tobin et al., 2012). Tras liberarse en sitios sinápticos, la AVP y OT se unen a sus receptores (Liu et al., 1994) pero luego no son recicladas y pueden difundir y actuar sobre neuronas distantes (Zoli & Agnati, 1996). Los nonapéptidos también se liberan extra-sinápticamente actuando sobre amplias regiones. Este tipo de transmisión extra-sináptica se denomina transmisión de volumen y parece jugar un papel importante en la modulación nonapeptidérgica (Landgraf & Neumann, 2004; Trueta & De-Miguel, 2012), que podría deber su eficacia a una combinación de transmisión sináptica precisa y extra-sináptica difusa. Un hecho que refuerza la importancia de la transmisión de volumen, es la frecuente disparidad entre la localización de la inervación nonapeptidérgica y el respectivo receptor. En cualquier caso, los receptores para AVP y OT están localizados en regiones bien definidas, donde los circuitos locales son muy importantes en la modulación nonapeptidérgica. En una revisión reciente, Stoop (2012) discute este hecho, además de la interacción entre AVP y OT en sus acciones neuromoduladoras. 1.5. Datos previos y justificación del trabajo Los roedores son ampliamente utilizados en la investigación de la neurobiología del comportamiento social (Bosch, 2011; Nephew & Bridges, 2008; Takahashi & Miczek, 2013; Toth & Neumann, 2013). La información anatómica procedente de estudios en ratas muestra que tanto la SBN como el sistema mesolímbico del refuerzo (según las definiciones de Newman 1999 y O'Connell & Hofmann 2012) expresan receptores para AVP y OT (Veinante & Freund-Mercier, 1997), y muestran una importante inervación vasopresinérgica (DeVries et al., 1985). Sin embargo, no hay apenas información sobre la distribución de oxitocina, salvo el mapeo de células oxitocinérgicas en el hipotálamo (Hou-Yu et al., 1986). Los ratones se están convirtiendo en la especie de elección en los estudios de neurobiología del comportamiento social. Por un lado, se están identificando las feromonas que median las interacciones sociales en el ratón (Chamero et al., 2007; Isogai et al., 2011; Nodari et al., 2008; Roberts et al., 2010). Por otro, porque ya hay disponibles una gran variedad de ratones modificados genéticamente que generan información muy útil sobre las bases del comportamiento social (Bielsky et al., 2005; H K Caldwell et al., 2008; Dölen et al., 2013; Egashira et al., 2007; Jin et al., 2007; Nishimori et al., 2008; Pobbe et al., 2012). Sin embargo, la información neuroanatómica es muy escasa en ratón en comparación con la rata. Respecto a los nonapéptidos, recientemente se han publicado varias descripciones de la distribución de AVP, aunque en la cepa endogámica C57BL/6 (Rood & De Vries 2011). Es interesante comparar esta información la de otras cepas, como por ejemplo la CD1, que presenta niveles de agresividad significativamente mayores y menor ansiedad que muchas cepas endogámicas como la C57BL (Parmigiani et al., 1999). Por lo tanto, se necesita una descripción detallada de los sistemas vasopresinérgicos de varias cepas de ratón, prestando especial atención a las áreas cerebrales que dirigen el comportamiento socio-sexual. Consecuentemente, el primer objetivo del presente trabajo es proporcionar una descripción anatómica precisa de los elementos vasopresinérgicos en el cerebro de la cepa CD1 de ratón, centrándonos en los nodos de la SBN. También analizaremos la presencia de dimorfismo sexual (descrito en otras especies) y el control esteroideo de la expresión de AVP. Prestaremos especial atención al mvStP, dada su participación en la expresión de comportamientos sexualmente dimórficos, el input quimiosensorial que recibe y su conectividad (que lo sitúa entre el SBN y el sistema de refuerzo mesolímbico). En el caso de la oxitocina, solo existe una descripción previa de su distribución en el encéfalo del ratón (Castel & Morris, 1988). Se necesita urgentemente un re-análisis y descripción detalladas. Además, los datos sobre la distribución de receptores para AVP (Dubois-Dauphin, Barberis, & De Bilbao, 1996) y OT (Insel et al. 1993; Hammock & Levitt, 2013) refuerzan la idea de una clara discordancia entre la distribución de fibras nonapeptidérgicas y sus receptores. En el escenario que acabamos de exponer, se hace evidente la necesidad de identificar los lugares de liberación de AVP y OT y su contenido relativo para entender mejor su funcionalidad (Merighi et al., 1989; Stoop, 2012). Por lo tanto, sería muy interesante comparar la distribución de AVP y OT. Aunque tradicionalmente se considera que la AVP y OT son expresadas de manera excluyente, hay evidencia de que la mayoría de células nonapeptidérgicas sintetizan ambos RNAs (Glasgow et al., 1999; Xi et al., 1999). Esta co-expresión es funcionalmente relevante, dado que se ve alterada en condiciones fisiológicas como la privación de agua (Telleria-Diaz et al., 2001) o la maternidad (Mezey & Kiss, 1991). Sin embargo, no existe ningún trabajo sobre los patrones basales de co-expresión de ambos nonapéptidos. 1.6. Objetivos específicos del trabajo 1. Describir la distribución de vasopresina en el cerebro de ratones CD1 y analizar la presencia de dimorfismo sexual y su control hormonal. Nos centraremos en el estriado-pálido ventral, dado su posible papel modulador del comportamiento social mediado por feromonas. 2. Trazar el origen de la inervación sexualmente dimórfica del estriado-pálido ventral, para entender mejor su relación en el SBN. 3. Realizar de una descripción detallada de la distribución de oxitocina en el cerebro de ratones CD1. 4. Comparar directamente la distribución de AVP y OT en el mismo material, analizando la presencia de elementos en los que se co-expresan ambos nonapéptidos. 2. METODOLOGÍA Para este trabajo, utilizamos 62 ratones adultos de la cepa CD1 (de 9 a 16 semanas de edad; Harlan, Barcelona, España; Janvier-Europe, Le Genest Saint Isle, France). Los animales fueron tratados de acuerdo con la normativa de la comunidad europea del 24 de noviembre, 1986 97 (86/609/EEC) y todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de ética y experimentación animal de la Universitat de València. 2.1. Experimento 1. Distribución de la inmunoreactividad de AVP en los hemisferios cerebrales del ratón y análisis de su dimorfismo sexual En este experimento procesamos un total de 24 machos adultos y 15 hembras adultas para la inmunohistoquímica de AVP. 2.1.1. Inyecciones de colchicina Antes del procesado para inmunohistoquímica, seis de los animales (3 hembras y 3 machos) recibieron inyecciones intracerebrales de colchicina para inhibir el transporte axónico e incrementar así el marcaje en somas neuronales. Brevemente, cada animal se mantuvo bajo anestesia gaseosa (Isofluorano al 2%) en un marco estereotáxico. Tras realizar una incisión longitudinal en la piel del cráneo, se tomaron las referencias en las suturas craneales y se trepanó un pequeño orificio sobre uno de los ventrículos laterales (según un atlas de referencia). Mediante un capilar de vidrio, inyectamos una solución salina con unos 30 microgramos de colchicina en uno de los ventrículos laterales. Tras día y medio de supervivencia, los animales fueron sacrificados y procesados como se indica en el punto 1.3. 2.1.2. Orquidectomía Datos previos en varios vertebrados muestran que la inervación AVP-ir en varios centros cerebrales es sexualmente dimórfica. Para explorar si esto es cierto también para el mvStP, estudiamos la densidad de fibras AVP-ir en tres grupos de hembras, machos y machos castrados (n=9 por grupo). Para la gonadecomía de los machos, los animales fueron anestesiado con pentobarbital según Shipley & Adamek (1984). Administramos atropina (0.4 mg/kg) para prevenir la depresión cardio-respiratoria y 0.02 mg/kg (subcutáneos) de buprenorfina como analgésico y extrajimos las gónadas a través de una sola incisión en el saco escrotal. Tras tres semanas de recuperación (para asegurar el descenso en los niveles de testosterona), tanto los machos castrados como los machos intactos y las hembras fueron sacrificados y procesados como se indica en el punto 1.3. 2.1.3. Perfusión, fijación y corte Los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de pentobarbital y perfundidos transcardíacamente con de solución salina (5.5 mL) seguida de paraformaldehido al 4% en tampón fosfato 0.1M pH 7.4 a razón de 5.5 mL/min. Los encéfalos fueron extraídos cuidadosamente y sumergidos en sacarosa al 30% en tampón fosfato para su crioprotección, durante cinco días. Acto seguido, los seccionamos en un micrótomo de congelación y recogimos los cortes en cinco series paralelas. La primera y tercera series se usaron para la detección inmunohistoquímica de AVP, mientras que la segunda serie fue procesada para la tinción de Nissl o inmunohistoquímica del marcador neuronal NeuN. El resto de series fueron congeladas (-18ºC) para su uso posterior. En algunos casos, una cuarta serie fue procesada para la inmunodetección de substancia P o la histoquímica de NADPH diaforasa, para delimitar la arquitectura del mvStP y la amígdala, respectivamente. 2.1.4. Inmunohistoquímica Para la inmunohistoquímica utilizamos el método indirecto estandarizado del complejo Avidina-biotina-peroxidasa (ABC), con sucesivas incubaciones en solución de bloqueo, anticuerpo primario y secundario y ABC (según la metodología y diluciones indicadas en la Tabla 1), lavando cuidadosamente entre cada paso. Finalmente, las preparaciones fueron reveladas con diaminobenzidina, montadas y cubiertas para hacerlas permanentes. Table 1. Anticuerpos y procedimiento de los experimentos 1 y 2. Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario Dilución Rabbit anti-Vasopressin IgG (Millipore Cat#AB1565) Antigen: Full-length vasopressin Inmunogen: Synthetic vasopressin conjugated to thyroglobulin 1:10,000 Biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vector Labs, BA-1000) 1:200 1:2,500 Alexa Fluor 546-conjugated Goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes, A-11071) 1:300 Mouse anti-NeuN IgG (Millipore Cat#MAB377) 1:5,000 Biotinylated horse anti-mouse IgG (Vector Labs, BA-2000) 1:300 Rabbit anti-Substance P IgG (Millipore Cat#AB1566) 1:10,000 Biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vector Labs, BA-1000) 1:200 2.1.5. Histoquímica para NADPH diaforasa y combinación con inmunohistoquímica para AVP Para la detección histoquímica de NADPH diaforasa se siguió el protocolo de Barbaresi, Quaranta, Amoroso, Mensà, & Fabri (2012). Para el doble marcaje, utilizamos dos series de un animal que había recibido inyección de colchicina: realizamos primero la inmunohistoquímica contra AVP, seguida de la histoquímica para NADPH diaforasa. 2.1.6. Estudio de las preparaciones Las preparaciones histológicas se estudiaron con un microscopio Leitz DMRB (Leica AG, Germany) y se fotografiaron con una cámara acoplada (Leica DFC300 FX). Las imágenes se procesaron con ImageJ para optimizar el brillo y contraste sin retoque alguno, y las figuras fueron elaboradas con Gimp (ambos programas de software libre). 2.1.7. Análisis del dimorfismo sexual Para comparar los sistemas vasopresinérgicos entre machos, machos castrados y hembras, realizamos análisis cuantitativos de la inervación AVP-ir en una región con dimorfismo sexual ya descrito (septum lateral, LS), el campo terminal del mvStP y otra región del estriado ventral (núcleo accumbens, Acb). Tomamos fotografías digitales de las áreas seleccionadas, restamos el fondo y normalizamos el histograma usando ImageJ. Sobre el canal verde, binarizamos la imagen usando la misma regla para todos los casos: los píxeles con un nivel de gris menor del 80% de la moda fueron seleccionados como fibras marcadas. Registramos la fracción de área ocupada por estos píxeles en las regiones seleccionadas en cada animal. En los mismos animales, tomamos fotografías de secciones de la división posteromedial del núcleo lecho de la stria terminalis (BSTMP). Una persona sin conocimiento del grupo experimental contó el número de células AVP-ir usando ImageJ, en los tres grupos experimentales. Analizamos estadísticamente la fracción de área ocupada por la inervación AVP-ir y el contaje de somas AVP-ir con el software SPSS. Después de comprobar la normalidad de los datos (Kolmogorov-Smirnov con corrección de Lilliefor) y la homogeinicidad de la varianza (Levene), realizamos una ANOVA de una vía para buscar diferencias inter-grupo en el marcaje de cada área. Cuando ser encontraron diferencias, realizamos comparaciones post-hoc para localizarlas (correcciones de Bonferroni o Games-Howell). Además, buscamos posibles correlaciones entre la densidad de la inervación y el número de somas marcados en las diferentes regiones analizadas, mediante el test de Pearson. 2.2. Experimento 2. Origen de la inervación AVP-ir en el estriado-pálido ventral. La correlación positiva entre la densidad de la inervación del mvStP y el número de somas en el BSTMP sugiere la existencia de una proyección desde el BSTMP al mvStP. El experimento 2 se diseñó para comprobar dicha hipótesis. 2.2.1. Trazado retrógrado de aferencias al mvStP Una primera aproximación consistió en utilizar un trazador retrógrado fluorescente (Fluorogold, FG) en combinación con la detección AVP mediante inmunofluorescencia. Para inyectar el FG utilizamos un método similar al del experimento 1 en la administración de colchicina, usando capilares de vidrio de unos 15µm de diámetro interno en la punta. Administramos el FG mediante iontoforesis (+5 µA durante 5-10min; 7s ON, 7s OFF), a partir de una solución al 2%. Para evitar atravesar estructuras que pudieran dar un falso positivo al recibir trazador durante la trayectoria de la pipeta (como el septum lateral), realizamos las inyecciones con un ángulo lateral de 25 grados (siendo las coordenadas relativas a Bregma, en milímetros: AP-1.42, L0.20, DV-4.00 desde la meninge). Tras una semana de supervivencia, los animales fueron sacrificados y procesados como en el experimento 1. Dos de las cinco series fueron procesadas para la inmunodetección de AVP usando anticuerpos secundarios fluorescentes, según lo especificado en la Tabla 1 (arriba). Una vez montadas y cubiertas las preparaciones, analizamos las muestras mediante epifluorescencia (Leica EL-6000 en el microscopio mencionado arriba) usando filtros específicos para fluorogold y rodamina. Ajustamos el brillo y contraste con ImageJ sin retoque alguno de la imagen. 2.2.2. Lesiones excitotóxicas del BSTM En una segunda aproximación, realizamos lesiones excitotóxicas unilaterales del BSTMP sin dañar las fibras de paso, mediante inyección estereotáxica de ácido iboténico. Para ello realizamos cirugía estereotáxica en 12 machos, de forma similar a la administración de cochicina (experimento 1) y FG. Inyectamos 150nl de ácido iboténico 60mM en el BSTMP de uno de los hemisferios cerebrales, mediante presión hidráulica, usando un capilar de vidrio sellado con silicona y unido a una jeringa Hamilton. Para evitar la entrada de ácido iboténico en los ventrículos laterales (próximos al BSTM), entramos con un ángulo antero-posterior de 23 grados e inyectamos la solución a un ritmo de unos 15nL/min (coordenadas desde Bregma, en milímetros: AP-2.25, L0.85, DV4.85 desde meninge). Tras una semana de supervivencia, sacrificamos y procesamos los animales como en el experimento 1. Procesamos 2 series para el marcador neuronal NeuN (para delimitar la lesión) y para AVP, respectivamente, siguiendo el mismo procedimiento que en el experimento 1 (Tabla 1). Para analizar los efectos de la lesión, comparamos la densidad de somas en el BSTMP y de fibras en el mvStP, septum lateral y amígdala medial posterodorsal, entre el hemisferio lesionado y el no lesionado, como en el experimento 1. El objetivo era comprobar la hipótesis de que la disminución de somas AVP-ir en el BSTMP del hemisferio lesionado estaba correlacionada con la disminución de fibras en las áreas supuestamente receptoras de sus proyecciones AVP-ir, utilizando el hemisferio no lesionado como control intra-sujeto. Utilizamos un t de Student para medidas relacionadas comparando ambos hemisferios, y una correlación de Pearson entre número de somas y densidad de fibras en los campos terminales. 2.3. Experimento 3. Distribución de la imunoreactividad para OT Obtuvimos preparaciones de inmunohistoquímica para OT en 10 hembras y 2 machos vírgenes de la cepa CD1. Los animales fueron sacrificados y procesados como el en Experimento 1, pero recogimos los cortes en cuatro series paralelas en lugar de cinco. Para la inmunohistoquímica, empleamos el método indirecto ABC como en el Experimento 1 (para anticuerpos y diluciones ver Tabla 2). Estudiamos las preparaciones histológicas y elaboramos las figuras usando la misma metodología que en el experimento 1. Tabla 2. Anticuerpos y diluciones para inmunohistoquímica en el experimento 3 Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario Dilución Mouse anti-oxytocin, monoclonal (Dr. Harold Gainer, NIH Cat#PS38) Antigen: Oxytocin-specific neurophysin Inmunogen: Rat posterior pituitary extract, KLH coupled 1:600 Biotinylated goat anti-mouse IgG (Vector Labs, BA-9200) 1:200 Rabbit anti-Oxytocin IgG (Millipore Cat#AB911) Antigen: Full-length oxytocin Inmunogen: Synthetic oxytocin conjugated to thyroglobulin 1:25,000 Biotinylated goat anti-rabbit IgG (Vector Labs, BA-1000) 1:200 2.4. Experimento 4. Análisis de la co-localización de OT+AVP Para el marcaje simultáneo de oxitocina y vasopresina combinamos la detección de ambos péptidos mediante inmunofluorescencia. Usamos dos de las cuatro series obtenidas de tres machos y tres hembras vírgenes. Brevemente, incubamos las series en borohidruro sódico (para reducir la autofluorescencia tisular), incubamos en solución de bloqueo, anticuerpo primario y secundario marcado con fluoróforo, lavando cuidadosamente entre cada paso (Tabla 3). Para revelar la citoarquitectura en las secciones, contrateñimos con DAPI. Finalmente, montamos los cortes en portaobjetos gelatinizados y cubrimos con medio de montaje para fluorescencia. Analizamos las preparaciones con un microscopio confocal Olympus FV1000 invertido, escaneando en tres canales para identificar el DAPI, Alexa Fluor 488 (AVP) y Rodamina (OT). Las longitudes de onda de excitación fueron 405 nm para DAPI, 488 nm para Alexa Fluor 488 y 559 nm para Rodamina Red-X. Las longitudes de onda de emisión fueron 461, 520 y 591 respectivamente. Las secciones del plano Z se tomaron separadas entre 1.5 y 4 micras, a x100, x200 y x600 aumentos, en las regiones de interés. Para minimizar el cruce de señal entre canales adquirimos las imágenes de forma secuencial, y las guardamos en formato TIF y OIF. Procesamos los stacks obtenidos con ImageJ para optimizar el brillo y contraste, sin realizar manipulaciones de elementos individuales. Finalmente, elaboramos las figuras con GIMP. Table 3. Antibodies and immunoprocedure of experiment 4 Primary antibody Dilution Secondary antibody Dilution Mouse anti-oxytocin, monoclonal (Dr. Harold Gainer, NIH Cat#PS38) 1:200 Rhodamine Red X-conjugated goat anti-mouse IgG (Invitrogen R6393) 1:250 Rabbit anti-Vasopressin IgG (Millipore Cat#AB1565) 1:2,500 Alexa Fluor 488-conjugated Goat anti-rabbit IgG (Jackson ImmunoResearch, 111-545-003) 1:300 3. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS El presente trabajo constituye la primera descripción completa de los sistemas nonapeptidérgicos del cerebro del ratón. Aparte de los ya bien descritos centros neurosecretores del hipotálamo, nuestros experimentos revelan una serie de grupos celulares localizados principalmente en los hemisferios cerebrales del telencéfalo y en la frontera telencéfalo-diencefálica, que expresan AVP, OT o ambos péptidos simultáneamente. Además, describimos varios campos terminales que revelan la existencia de importantes proyecciones centrales nonapeptidérgicas, con posible papel en la modulación de comportamientos sociales. 3.1. Los elementos AVP-ir en los hemisferios cerebrales del ratón Al comparar los resultados con la bibliografía, parece que los circuitos AVP-ir se encuentran muy conservados en mamíferos. El cerebro del ratón contiene una población AVP-ir sexualmente dimórfica, que da lugar a la inervación AVP-ir de la mayor parte de los nodos de la SBN. Además, varios centros de la amígdala subpalial muestran inervación AVP-ir no dimórfica. La amígdala medial muestra inervación AVP-ir tanto dimórfica como no dimórfica, probablemente involucradas en la modulación de diferentes componentes del comportamiento social. Por último, nuestros datos nos permiten identificar un nuevo caso de dimorfismo sexual en la inervación AVP-ir del mvStP, lo que apunta a un rol de este centro en el SBN, donde estaría involucrado en el control motivacional de las interacciones sociales. En líneas generales, nuestros resultados sobre la distribución de elementos AVP-ir en la cepa CD1 de ratón (Fig. 1) concuerdan con los publicados en la cepa C57BL (Ho et al., 2010; Plumari et al., 2002; B D Rood & de Vries, 2011). Además, nuestros datos evidencian una discordancia entre la distribución de fibras AVP-ir y la distribución de receptores para el neuropéptido. Dicha disparidad puede atribuirse en algunos casos (como el de la amígdala medial) a la promiscuidad de receptores (Manning et al., 2012), pudiendo ocurrir que la AVP liberada actúe sobre receptore OTR. Otra explicación es que la AVP liberada podría difundir y actuar sobre receptores V1aR situados a cierta distancia, mediante transmisión de volumen (Landgraf & Neumann, 2004). Por otro lado, nuestro material revela algunos hallazgos novedosos sobre el sistema AVPérgico. Primero, caracterizamos tres poblaciones AVP-ir además de las tres ya descritas pertenecientes a los núcleos hipotalámicos neuorsecretores (paraventricular, supraóptico y supraquiasmático). Dos de ellas son sexualmente dimórficas (a favor de los machos) y testosterona-dependientes: están localizadas en ambos polos de la amígdala extendida, una en el BST intraamigdalino (BSTIA; Fig. 1k-l y Fig. 2d) y la otra en el BST medial posteriointermedio (BSTMPI; Fig. 1f-g y Fig. 2a; Fig. 3). La tercera, que no muestra dimorfismo sexual (pero una tendencia a mayor dominancia en hembras) se encuentra situada en la región dorsal-anterior del área preóptica medial, flanqueada lateralmente por el BST posterior, dorsalmente por el núcleo de la comisura anterior (AC) y medialmente por el núcleo preóptico antero-dorsal (ADP) que hemos denominado el grupo ADP/AC. Además esta última población co-expresa NADPH-diaforasa (Fig. 1 f-g y Fig. 2 a-c). Como describimos más adelante, la mayoría de estas células co-expresan también oxitocina. Estos resultados refuerzan el concepto de amígdala medial extendida propuesto por Alheid & Heimer (1988) y muestran la dependencia de testosterona de las poblaciones AVP-ir de esta región cerebral (Fig. 6). Además, los resultados revelan una relación entre el número de células AVP-ir en el BSTMPI y la densidad de la inervación AVP-ir de la amígdala medial posterodorsal, el septum lateral (ya descrita anteriormente), y el mvStP (Experimento 2, Tabla 2). Además, el trazado retrógrado de las proyecciones AVP-ir al mvStP confirma el origen (al menos parcial) de dichas fibras en el BSTMPI (Fig. 7). Las lesiones del BSTMP disminuyen la inervación AVP-ir del mvStP, amígdala medial y septum lateral, indicando que el grupo dimórfico del BST medial origina también (al menos parcialmente) la inervación AVP-ir de la amígdala medial y el septum lateral (Fig. 8). Utilizando preparaciones inmunohistoquímicas y tinciones histológicas, delimitamos el área inervada por las fibras AVP-ir (Fig. 4). La distribución dimórfica de la inervación AVP-ir en el mvStP es indicativa de su papel en la SBN, ya que además el mvStP cumple con otros los criterios para su inclusión en dicha red, de la que depende el comportamiento socio-sexual (Newman 1999b): está involucrado en varias conductas sociales, como el comportamiento paternal (Akther et al., 2014) y los vínculos de pareja (Larry J Young & Wang, 2004); está interconectada con otras áreas del SBN; y expresa gran cantidad de receptores para esteroides sexuales (Mitra et al., 2003; Shughrue & Merchenthaler, 2001). Esta región parece estar situada en la intersección entre el SBN y el sistema mesolímbico del refuerzo y la motivación, como ocurre con el septum lateral y la amígdala medial extendida, según O'Connell & Hofmann (2011) (Fig. 15). Por último, en nuestras preparaciones las fibras AVP-ir no dimórficas de la amígdala central muestran una gran variabilidad inter-individual. Dicha variación podría estar relacionada con diferencias en la expresión de comportamientos de miedo, ansiedad, maternales, etc. Como demuestran Knobloch et al. (2012) en el caso de la oxitocina. Otro descubrimiento relevante, es el de la presencia de gruesos procesos AVP-ir (no dimórficos) en la porción ventral de la amígdala medial, aparentemente dendritas procedentes de los somas neurosecretores del núcleo supraóptico anterior (Fig. 5a-b). Smithson et al. (1989; 1992) encontraron estructuras similares en rata, y describieron inputs olfativos directos sobre las células del núcleo supraóptico (Hatton & Yang, 1989). El gran tamaño de estos procesos dendríticos en el cerebro del ratón podría tener importantes implicaciones funcionales si liberaran AVP mediante el mecanismo de liberación dendrítica descrito por Ludwig and Leng (2006). 3.2. Los elementos OT-ir en el encéfalo del ratón La distribución de elementos OT-ir se asemeja a la observada en otros mamíferos como macacos (Caffé et al., 1989), musarañas arborícolas (Ni et al., 2014), ratas topo lampiñas (Rosen et al., 2008; Valesky et al., 2012), topillos (Z. Wang et al., 1996), hamsters (L. Xu et al., 2010), ratas (Buijs et al., 1978) y diferentes especies de ratón (Castel & Morris, 1988; Hermes et al., 1988). Sin embargo, nuestro trabajo aporta una descripción detallada de la distribución y localización de elementos OT-ir (Fig. 9), que no existía para el ratón, principal especie usada en el estudio de la neurobiología del comportamiento social. La distribución de células OT-ir sugiere su origen embrionario común, concretamente de la región supraopto-paraventricular del neuroepitelio embrionario (Garcia-Moreno et al., 2010). En nuestro material, las células OT-ir del núcleo supraóptico mostraron menor inmunoreactividad que las del resto del hipotálamo. Esto podría deberse a una menor tasa de síntesis o mayor tasa de transporte anterógrado del péptido. Al estudiar el grupo OT-ir del ADP/AC, destacan sus similitudes con las células AVP-ir de la misma región. Además estas células OT-ir se encuentran a menudo asociadas a vaso sanguíneos (Fig. 10a-b) (ver Muchlinski et al. 1988), lo que posibilita su participación en procesos neurosecretores, aunque no proyecten a la pituitaria (Ross et al., 2009). Esto podría explicar la correlación entre algunos rasgos del comportamiento y los niveles circulantes de oxitocina y daría una respuesta alternativa a la acción de este neuropéptido como hormona moduladora de la conducta, habida cuenta de la impermeabilidad de la barrera hematoencefálica para la oxiti¡ocina. En cuanto a la inervación OT-ir del encéfalo, la mayoría de fibras observadas corresponden a las fibras neurosecretoras del hipotálamo. Sin embargo, observamos importantes campos terminales con fibras de diferentes morfologías en áreas concretas del sistema nervioso central, lo que sugiere la presencia de varios circuitos OTérgicos originados en las células OT-ir hipotalámico-preópticas. En el telencéfalo rostral, la inervación OT-ir es escasa y muestra una gran variabilidad inter-individual en términos de abundancia. Es tentador especular que la variabilidad en la inervación nonapeptidérgica en áreas prefrontales pueda estar relacionada con variaciones inter-individuales en comportamiento social. El BST anterior y las regiones adyacentes del hipotálamo prepótico muestran gruesos procesos OT-ir que podrían provenir de los somas del cercano ADP/AC, y/o ser fibras de paso hacia el núcleo accumbens. En la amígdala central, también encontramos fibras gruesas intensamente inmunoreactivas, que podrían estar implicadas en la regulación del comportamiento maternal (según evidencia obtenida en ratas). Sin embargo, a diferencia de lo descrito por Knobloch et al. (2012) en ratas, nosotros no vemos diferencias en la inervación de las diferentes divisiones de la amígdala central. Esta inervación también muestra gran variabilidad inter-individual, como ocurre en áreas fronto-temporales que se encuentran conectadas con la amígdala, lo que también podría tener implicaciones funcionales. Otras áreas funcionalmente relevantes presentan inervación OT-ir. El hipotálamo dorsomedial, que participa en reflejos de eyección de leche (Takano et al. 1992), muestra fibras de diferente grosor (Fig. 9k y 10c). La sustancia gris periacueductal presenta una inervación notable (Fig. 9 l, m), que podría mediar en la nocicepción o analgesia (Yang et al. 2011). También hay fibras marcadas en la substancia nigra y área ventral tegmental, donde la OT parece regular funciones como el comportamiento maternal (Pedersen et al. 1997), la ingesta de comida (Mullis et al. 2013) y erección del pene (Melis et al. 2007). Finalmente, el núcleo del rafe magno contiene gran cantidad de fibras OT-ir, que podrían estar regulando los niveles de agresión (Yoshida et al. 2009) y agresividad (Pagani et al. 2015) al actuar sobre neuronas serotoninérgicas (Eaton et al. 2012; Mottolese et al 2014). 3.3. Co-expresión de OT y AVP en el cerebro del ratón Los primeros estudios inmunohistoquímicos y de hibridación in situ sugerían que la OT y AVP se expresan de forma exclusiva en diferentes poblaciones de neuronas (Mohr et al. 1988). Esa visión de los sistemas oxitocinérgicos y vasopresinérgicos como independientes está aún vigente. Sin embargo, el uso de técnicas de PCR cuantitativa en células aisladas (Kiyama & Emson 1990; Glasgow et al. 1999) demuestran que casi todas las células neurosecretoras expresan ambos péptidos, aunque en proporciones diferentes que van desde 1:500, en células consideradas exclusivamente oxitocinérgicas o vasopresinérgicas, a 1:2 en células descritas como co-expresoras de ambos péptidos (Xi et al 1999). Esto refleja las limitaciones de las técnicas de inmunodetección o hibridación in situ. Teniendo en cuenta estas limitaciones, nuestros resultados muestran que la expresión de AVP y OT es complementaria, tanto en células como en fibras, en la mayoría de áreas analizadas. En el núcleo paraventricular nuestros resultados concuerdan con los de estudios previos en rata de Rhodes et al. (1981) y Hou-Yu et al (1986; ver Fig. 12). Sin embargo, la distribución que hemos encontrado en el núcleo supraóptico del ratón (Fig. 12) difiere de la descrita en la rata: en el ratón, las células AVP-ir son mucho más abundantes, y que las OT-ir están restringidas a la porción más rostro-medial del núcleo supraóptico. El núcleo supraóptico de la rata muestra una proporción parecida de células AVP-ir y OT-ir, entremezcladas en lugar de separadas como en el ratón. Un hallazgo muy relevante es la identificación de varias poblaciones que co-expresan OT y AVP a niveles inmunodetectables. En el núcleo paraventricular y en el supraóptico las células doblemente marcadas son una minoría y presentan, en general, niveles similares de immunofluorescencia para ambos nonapéptidos. En los núcleos accesorios del hipotálamo, la proporción de células doblemente marcadas parece mayor, aunque el patrón de marca es similar. Sin embargo, en la porción más rostral del núcleo paraventricular, la mayoría de las células intensamente OT-ir son también ligeramente inmunoreactivas para AVP. También en el ADP/AC, la mayoría de células presentan doble marcaje, con dominancia de OT frente a AVP. Esto refuerza la idea que estas células forman una población neuronal diferenciada dentro del cerebro del ratón, un nuevo núcleo. Algunas células en la amígdala medial también presentan este fenotipo (marca OT intensa y marca AVP débil). En cuanto a las fibras, encontramos un patrón de inmunoreactividad similar (doble marcaje con predominancia de OT) en la inervación de dos áreas cerebrales: el núcleo accumbens y la amígdala central. Esto sugiere que el origen de dicha inervación podría estar en el ADP/AC y/o el extremo rostral del núcleo paraventricular. La relativa baja abundancia, elevada inmunoreactividad y la ultraestructura de las fibras (Ross et al. 2009), junto a la distribución de receptores, sugiere un papel de dichas fibras en transmisión por volumen de OT y AVP en estos centros del telencéfalo. La liberación simultánea de ambos nonapéptidos y su proporción relativa podría tener importantes implicaciones en las funciones motivacionales y emocionales en las que participan el núcleo accumbens y la amígdala central, respectivamente. Además, el ADP/AC está localizado en una región clave para la expresión de los comportamientos maternales (Numan & Numan 1996), cuyas proyecciones al núcleo accumbens y a la amígdala central podrían estar modulando los componentes motivacionales y emocionales (Knobloch et al. 2012) del comportamiento maternal. 4. CONCLUSIONES FINALES 1. Las células inmunoreactivas para arginina-vasopresina (AVP-ir) están presentes en los núcleos hipotalámicos neurosecretores, además de en varios centros de los hemisferios cerebrales, incluyendo las porciones intra- y extra-amigdalinas del núcleo de la estría terminalis (BST) y la región situada entre el área preóptica anterodorsal y el núcleo de la comisura anterior (ADP/AC). Nuestros datos histoquímicos sugieren que las células situadas en la porción intra-amigdalina del BST habían sido previamente malinterpretadas como pertenecientes a la amígdala medial. 2. Los grupos celulares AVP-ir del BST medial posterointermedio son sexualmente dimórficos, siendo más abundantes en machos que en hembras. Los machos castrados muestran un fenotipo parecido al de las hembras, indicando que la expresión de AVP enm estas células depende de testosterona. 3. Las fibras inmunoreactivas para AVP forman densos campos terminales en varias áreas del cerebro, incluyendo todos los nodos de la red neural que dirige el comportamiento socio-sexual (la SBN). 4. Un análisis cuantitativo de la densidad de fibras AVP-ir en los centros localizados en los hemisferios cerebrales, concretamente en el septum lateral, la amígdala medial posterodorsal y el estriado-pálido medioventral, indica que la densidad de estos campos terminales es mayor en machos que en hembras. En machos, la densidad de esta inervación AVP-ir depende de testosterona. 5. El campo terminal AVP-ir del estriado-pálido medioventral cubre un área mal definida citoarquitectónicamente, localizada entre el núcleo accumbens y la banda diagonal ventral, que no se corresponde con el pálido ventral. 6. Mediante técnicas de trazado de conexiones combinadas con inmunohistoquímica, y el análisis de los efectos de lesiones unilaterales del BST en la densidad de la inervación AVP-ir en el estriado-pálido medioventral, concluimos que dicha inervación proviene del grupo celular sexualmente dimórfico del BST. 7. La evidencia mencionada indica que el estriado-pálido medioventral es un nodo clave en la interfase entre el SBN y el sistema mesolímbico del refuerzo, pudiendo jugar un papel importante en la expresión de comportamientos socio-sexuales motivados. 8. Además del sistema vasopresinérgico sexualmente dimórfico, dos regiones de la amígdala muestran procesos inmunoreactivos no dimórficos, como son las fibras con morfología axónica en la amígdala central y los procesos con aspecto dendrítico en la amígdala medial ventral. Los procesos de la amígdala medial ventral parecen originarse en las células de la porción anterior del núcleo supraóptico. 9. Al igual que para AVP, las células inmunoreactivas para OT (OT-ir) se concentran en los núcleos neurosecretores hipotalámicos, pero encontramos poblaciones adicionales en los núcleos accesorios y en el ADP/AC. 10. En contraste con AVP, los grupos celulares OT-ir no presentan dimorfismo sexual aparente. De la misma forma, los campos terminales OT-ir son similares en machos y hembras. 11. Como regla general, los campos terminales OT-ir son más escasos y menos extensos que sus equivalentes AVP-ir. Salvo contadas excepciones, como la sustancia gris periqueductal, las inervaciones OT- y AVP-ir no se solapan y cubren regiones adyacentes. 12. La doble inmunofluorescencia para OT y AVP revela células doblemente marcadas, que son muy escasas en el hipotálamo neurosecretor, pero se concentran en la región rostral del núcleo paraventricular y en el ADP/AC. Esta población está compuesta mayortariamente por células intensamente inmunoreactivas para OT y débilmente para AVP. 13. Igualmente, los experimentos de doble marcaje revelan fibras marcadas para ambos péptidos en dos localizaciones cerebrales: el núcleo accumbens (shell y core) y las diferentes divisiones de la amígdala central. Estas fibras muestran un patrón de inmunoreactividad similar al de las neuronas preópticas/paraventriculares. 14. Esta evidencia sugiere que la inervación nonapeptidérgica del núcleo accumbens y de la amígdala central puede originarse en las células del ADP/AC y el polo rostral del núcleo paraventricular. 15. La localización y posibles proyecciones nonapeptidérgicas al núcleo accumbens y amígdala central, sugiere que el ADP/AC corresponde a la región ventral al BST que, según Neuman y Neuman (1996), es crítica para la expresión de comportamiento maternal en ratas.