Síntesis de Protoberberinas y Ciclopentil-isoquinoleínas Dopaminérgicas, y Síntesis de Indenopiridinas Melatoninérgicas

Resumen

Resumen – Discusión de los resultados. En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado diversas rutas de síntesis para la obtención de alcaloides isoquinoleínicos, con diferentes esqueletos, y de hexahidroindenopiridinas. Además se han realizado sus correspondientes ensayos farmacológicos, sobre distintas dianas biológicas basándonos en los resultados obtenidos previamente con este tipo de alcaloides de síntesis y/o aislados de la naturaleza, y de moléculas estructuralmente similares. Se ha observado, a lo largo de muchos años, que las IQ son uno de los metabolitos secundarios activos (MSA) más abundantes y de mayor interés farmacológico de los aislados en especies de la familia de las Annonáceas. Las azafluorenonas, alcaloides piridínicos presentes también en Annonáceas, y con propiedades antipalúdicas, nos has servido de inspiración para la síntesis de las HHIP. Los dianas biológicas para las que se ha desarrollado la síntesis de estos nuevos fármacos son: a)- IQ con afinidad por los Receptores Dopaminérgicos D1 y D2. b)- HHIP con afinidad por los Receptores Melatoninérgicos MT1 y MT2. c)- IQ con actividad antimicrobiana. d)- IQ con actividad antitumoral. Así pues, los Artículos que forman parte de la presente Tesis Doctoral se pueden dividir en tres capítulos: Capítulo 1: Alcaloides Isoquinoleínicos con afinidad por los Receptores Dopaminérgicos - Modelización Molecular sobre Receptores Dopaminérgicos: Artículos 1, 2 y 3. Capítulo 2: Alcaloides Indenopiridínicos con afinidad por los Receptores Melatoninérgicos: Artículos 4 y 5. Capítulo 3: Alcaloides Isoquinoleínicos con actividad antimicrobiana y antitumoral: Artículos 6 y 7. Capítulo 1. Artículo 1: “2,3,9- and 2,3,11- Trisubstituted tetrahydroprotoberberines as D2 dopaminergic ligands ” (En: European Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 68, 150) La dopamina es un neurotransmisor que tiene una importante función en el sistema nervioso central. Un desorden en el sistema dopaminérgico conduce a la aparición de alteraciones neurológicas y psiquiátricas importantes como la esquizofrenia y/o la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, la investigación en este campo tratará de sintetizar nuevos fármacos que posean una mayor afinidad por los RD D1 y D2 y poder paliar este tipo de enfermedades. Las tetrahidroprotoberberinas (THPB) son compuestos naturales existentes en diferentes especies vegetales, presentes como metabolitos secundarios activos (MSA). Este tipo de alcaloide isoquinoleínico contiene diversas actividades farmacológicas, incluyendo entre ellas la afinidad por los receptores dopaminérgicos (RD). Con el objetivo de mejorar la unión a dichos receptores, se desarrolló una ruta sintética mediante la que se obtuvieron tres series de THPB, obteniendo once moléculas finales a ensayar (Figura 19). Figura 19. Series de THPB. Existen diferentes métodos para la obtención de THPB. La ruta sintética que seguimos consta de cinco etapas. La primera es una reacción de Henry, mediante la cual se obtiene el ?-nitroestireno. Esta va seguida de una reducción para conseguir la feniletilamina, producto de partida en la siguiente etapa, para dar lugar, reaccionando con el cloruro de ácido adecuado, a la fenilacetamida correspondiente. A continuación, mediante una ciclodeshidratación de Bischler-Napieralski y posterior reducción, la fenilacetamida genera la 1-bencil-THIQ, producto de partida en la ciclación de Mannich mediante la cual se obtiene la THPB de interés. En este trabajo se ha estudiado la influencia de los sustituyentes sobre los anillos A y D de las THPB sintetizadas, en la afinidad por los RD. Así pues, se observó que la presencia de hidroxilos en el anillo A da lugar a un aumento de la afinidad por los RD D1 y D2 con respecto a los análogos que presentan las funciones oxigenadas bloqueadas. La presencia de un halógeno en el anillo A provoca un aumento de la afinidad por los RD D1, disminuyendo así la selectividad por los RD D2. Además se observó que la existencia de un grupo metilendioxi en las posiciones 2,3 produce una disminución de la selectividad por RD D2. En cuanto a los sustituyentes en el anillo D, la presencia de un grupo hidroxilo en posición 9 causa un aumento de la afinidad tanto por el RD D1 como por el D2, mientras que un hidroxilo en posición 11disminuye dicha afinidad (Figura 20). Así podemos destacar entre las 11 moléculas ensayadas 9f (2,3?OCH2O?9?OH), 6b (2,3?diOH?11?MeO) y 9d (2,3,9?triOH) por presentar mayor afinidad por los RD D2, y siendo esta última (9d) la que mostró mayor selectividad (ratio Ki D1/D2 de 40.6). Figura 20. Curvas de desplazamiento de [3H]-SCH 23390 (D1) y [3H] raclopride (D2) de binding específico para 9e y 9f. Datos obtenidos de 3-5 experimentos. Para entender mejor la interacción molecular que se establece entre los fármacos sintetizados y los RD D2, se realizaron estudios de modelización molecular mediante simulaciones moleculares dinámicas y cálculos mecánico cuánticos de tres de las THPB más activas (9c, 9d y 6b). De estas simulaciones se pudo concluir que las interacciones más importantes en la unión fármaco-receptor son las establecidas entre el Asp 114 y la amina protonada con carga positiva de la THPB y entre Ser 193 y/o Ser 194 y el grupo catecol del anillo A. Además, se observó que de las tres moléculas ensayadas la THPB 9d era la que mostraba ser más afín sobre el RD D2, puesto que poseía una elevada energía en la interacción con dicho receptor. Además, se realizaron ensayos de toxicidad celular en neutrófilos humanos, mediante técnica de MTT y de citometría de flujo, en las que se determinó que ninguna de las THPB sintetizadas eran citotóxicas. Artículo 2: “Synthesis of hexahydrocyclopenta[ij]isoquinolines as a new class of a dopaminergic agents” (En: European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 90, 101) Las THIQ son alcaloides naturales presentes en multitud de especies vegetales biosintetizados a partir de la tirosina y de la dopamina, por lo que se ha estudiado la afinidad de estos compuestos por los RD. En el Artículo 2 se ha desarrollado la síntesis de una serie de alcaloides tricíclicos llamados 1,2,3,7,8,8a-hexahidrociclopenta[ij]-isoquinoleínas (HCPIQ) con la finalidad de optimizar y mejorar la afinidad por los RD D1 y D2. La síntesis de este tipo de IQ comienza con la condensación de una feniletilamina y de un cloruro de ácido, que mediante condiciones de Schotten-Baumann darán lugar a la correspondiente fenilacetamida. Una ciclodeshidratación de Bischler-Napieralski seguida de una reducción de la imina intermediaria, genera el esqueleto IQ. La última etapa es una ciclación intramolecular mediante condiciones de Friedel-Crafts en la que se usa el reactivo de Eaton, generando en esta etapa el anillo ciclopentano (Figura 21). Reactivos y condiciones: (a) cloruro de cinnamoilo, CH2Cl2, NaOH 5 %, ta, 3h; (b) POCl3, acetonitrilo, N2, reflujo, 5h; (c) NaBH4; MeOH, ta, 2h; (d) Reactivo de Eaton (P2O5-CH3SO3H, 1:10 w/w), reflujo, 15h; (e) CH2Cl2, BBr3, ta, 2h; (f) metanol, formaldehido, acido fórmico, reflujo, 1h, seguido de NaBH4, reflujo, 1h; (g) CH3CN, K2CO3,cloruro de alilo, reflujo, 10h. Figura 21. Esquema sintético de las HCPIQ. En cuanto a la afinidad por los RD D1 y D2, se observó que todas las HCPIQ sintetizadas eran capaces de desplazar a los radioligandos específicos ([3H]-SCH 23390 (D1) y [3H] raclopride (D2)). Como en el caso de las THPB, aquellas que presentaban los hidroxilos libres poseían mayor capacidad de unión por los RD que los análogos correspondientes con los grupos oxigenados bloqueados. Las HCPIQ 3a, 3c y 3e poseían valores excepcionales de afinidad sobre los RD D2, 29, 13 y 18 nM respectivamente. Además, se observó, en toda la serie de este tipo de IQ, una muy elevada selectividad sobre los RD D2, destacando los compuestos 3a y 3c, con un valor de ratio D1/D2 de 2465 y 1010 respectivamente. En este trabajo también se realizaron ensayos de toxicidad celular sobre neutrófilos humanos, determinándose que ninguna de las HCPIQ sintetizadas eran citotóxicas. Artículo 3: “3-Chlorotyramine Acting as Ligand of the D2 Dopamine Receptor. Molecular Modeling, Synthesis and D2 Receptor Affinity” (En: Molecular informatics, 2014, in press) En este trabajo, se realizaron estudios de modelización molecular en los cuales se evaluaron las interacciones entre los compuestos y el RD D2 mediante la combinación de simulaciones de dinámica molecular (MD), semiempírica, ab initio y cálculos teóricos basados en el funcional de la densidad (DFT). En el segundo, se hizo uso de sistemas modelo reducido que nos permitió llevar a cabo cálculos de mecánica cuántica y estudios tipo teoría cuántica de átomos en moléculas (QTAIM). Figura 22. Dopamina y análogos clorados De las energías de unión obtenidas en las simulaciones se puede observar que la sustitución de un hidroxilo por un átomo de cloro (Figura 22, compuesto 3), aumenta la afinidad por el RD D2 en comparación con la dopamina (1). Sin embargo, la sustitución del OH en posición para por el cloro (2) ejerce el efecto contrario. Como ya se había sugerido en artículos anteriores del grupo del profesor Ricardo D. Enriz, que colabora activamente con nuestro grupo de investigación, la existencia de un resto carboxilo en el lugar de unión es muy importante para la interacción ligando-receptor, puesto que la fuerte interacción de los ligandos con el Asp 114 se mantuvo para todos los complejos evaluados. Respecto a la Val 115 (Figura 23), este aminoácido forma diversas interacciones con el anillo aromático de la dopamina. En cuanto a los restos serina, la Ser 197 aporta la mayor contribución a las energías de interacción de los complejos con los compuestos que poseen un hidroxilo en meta (1 y 2), mientras que la Ser 193 es más importante para el compuesto que tiene un cloro en esta posición (3). Por otro lado, el análisis de descomposición de residuos también revela una destacable contribución de la Phe 389, siendo más importante en el caso de los compuestos con hidroxilo en para (1 y 3). Figura 23. Energías de interacción para el compuesto 3. Capítulo 2. Artículo 4: “Synthesis of new melatoninergic hexahydroindenopyridines” (En: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, 3534) Las hexahidroindenopiridinas (HHIP) son moléculas alcaloídicas con un esqueleto novedoso que genera una nueva clase de compuestos con posible utilidad como agentes terapéuticos. Las HHIP se conocen por poseer varias actividades farmacológicas como lo son su actividad antiespermatogénica, antidepresiva y serotoninérgica, entre otras. Con objeto de obtener HHIP con diferentes sustituciones sobre posiciones clave dentro del esqueleto: posiciones 1, 7 y 8, que pudieran interaccionar selectivamente sobre los receptores de la melatonina, se desarrolló la siguiente ruta sintética (Figura 24). Reactivos y condiciones: (a) piperidina, TiCl4, tolueno seco, N2, ta, 3 días; (b) Hidrobromuro de 3-bromopropilamina, DMF seco, 110 ºC, 8 h; (c) NaBH4, EtOH, ta, 16 h. Figura 24. Ruta sintética para la obtención de HHIP 1b y 2b. En ella, se parte de 1-indanonas sustituidas en posiciones 5 y/o 6, comercialmente disponibles, y mediante una reacción catalítica con TiCl4 y piridina se produce la formación de la enamina correspondiente; la cual es sometida a una reacción de ciclación en la que se hace reaccionar con el hidrobromuro de 3-bromopropilamina, seguida de una reducción con borohidruro sódico, obteniendo así el esqueleto HHIP. A continuación se llevó a cabo la funcionalización del nitrógeno de las HHIP sintetizadas, para dar lugar a los compuestos que pudieran mimetizar los efectos de la melatonina sobre sus receptores específicos. De esta forma se prepararon por métodos clásicos los derivados N-acetilados, carbamatos y N-alquilados. Estudios preliminares de binding melatoninérgico de las HHIP sintetizadas, mostraron que dicho esqueleto convenientemente funcionalizado, constituye un farmacóforo adecuado con capacidad para unirse a los receptores de la melatonina MT1 y/o MT2, y de esta forma conseguir un nuevo agente inductor del sueño. Artículo 5: “Efficient synthesis of hexahydroindenopyridines and their potencial as melatoninergic ligands” (En: European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 700) La melatonina es una neurohormona que está implicado en procesos celulares, neuroendocrinos y neurofisiológicos. Se ha observado que alteraciones en el sistema melatoninérgico conducen a la aparición de enfermedades como insomnio y depresión, por lo que la investigación en este campo tiene como objetivo crear fármacos nuevos que posean una elevada afinidad por MT1 y MT2. Las hexahidroindenopiridinas (HHIP) son alcaloides tricíclicos que muestran semejanza estructural con la melatonina y con otros fármacos recientemente comercializados, como la agomelatina (Valdoxan®), indicados en problemas de insomnio. Es por ello que las HHIP han sido estudiadas por nuestro grupo, con objeto de obtener análogos con una mayor afinidad por los receptores melatoninérgicos (Figura 25). Figura 25. Melatonina, Agomelatina y HHIP. En este artículo se sintetizaron veinticinco HHIP, clasificados en 4 series, con una diferente sustitución sobre las posiciones 7 y 8 (Anillo A), dependiendo de la indanona de partida utilizada. A continuación preparamos los derivados correspondientes mediante funcionalización del nitrógeno de la amina secundaria. Todas estas moléculas sintetizadas fueron evaluadas como ligandos melatoninérgicos MT1 y MT2 mediante ensayos de binding. Así se observó que el compuesto 4g era capaz de desplazar al radioligando específico para MT1 y MT2 (2-[125I]-melatonina) en el rango nanomolar (Ki MT1 = 670 nM y Ki MT2 = 190 nM). Además se pudo concluir que el compuesto 2e fue selectivo para MT1 con una Ki = 500 nM y el compuesto 2f lo fue para MT2 con un valor de Ki = 380 nM (Figura 26). Figura 26. HHIP con afinidad por los receptores MT1 y MT2 Capítulo 3. Artículo 6. “Synthesis of pyrido[2,1-a]isoquinolin-4-ones and oxazino[2,3-a]isoquinolin-4-ones: New inhibitors of mitochondrial respiratory chain” (En: European Journal of Medicinal Chemistry 2013, 69, 69) La cadena respiratoria mitocondrial (CRM) de transporte electrónico comprende cuatro complejos enzimáticos (del I al IV), el coenzima Q (ubiquinona) y el citocromo C. Este sistema juega un papel esencial en la síntesis del ATP, el metabolismo de las especies reactivas del oxígeno y la apoptosis. Por ello, sus inhibidores presentan importantes perspectivas para convertirse en nuevos agentes antitumorales. Los alcaloides benzo[a]quinolicidínicos poseen interesantes propiedades biológicas, así como una similitud estructural con algunos inhibidores de la CRM conocidos. En este trabajo decidimos realizar la síntesis de moléculas con dicho esqueleto. Entre los métodos descritos en la literatura, elegimos el de Pemberton, puesto que nos permitía explorar la reactividad de las iminas y aprovecharnos de la diversidad estructural que proporcionaba, dado que con él se obtienen pirido[2,1-a]-IQ y oxazino[2,3-a]-IQ. Las diferentes iminas se sintetizaron mediante la ciclación de Bischler-Napieralski y se hicieron reaccionar con diferentes dioxinonas. El producto mayoritario obtenido de esta reacción depende del pH del medio: en condiciones neutras, los productos mayoritariamente aislados fueron las pirido[2,1-a]-IQ mientras que al añadir una base, se formaron preferentemente las oxazino[2,3-a]-IQ. Siguiendo este procedimiento se sintetizaron tres series de compuestos, a partir de tres iminas diferentes, dando un total de 11 compuestos a ensayar como posibles inhibidores de la CRM. Figura 27. Pirido[2,1-a]-IQ y oxazino[2,3-a]-IQ inhibidoras de la CRM. En general, las oxazino[2,3-a]-IQ mostraron mayor potencia que sus respectivos análogos piridínicos. Por ejemplo: el compuesto 1b (Figura 27) mostró una CI50 de 8.33 ?M mientras que su análogo oxigenado 1c presentó una capacidad de inhibición cinco veces superior. Una tendencia similar se observa en todos los productos ensayados. En cuanto al sustituyente en posición 2, un grupo fenilo mantuvo la actividad (1e) y un anillo furánico proporcionó el compuesto más activo, 1g. La desprotección de los metoxilos del anillo A (1h) también mantuvo la actividad. En el mismo sentido, cuando se introdujo un anillo aromático en posición 1 (series 2 y 3), las pirido[2,1-a]-IQ (2b, 3b) inhibieron la CRM con potencias moderadas, mientras que sus respectivos análogos oxazino[2,3-a]-IQ (2c, 3c) mostraron una mayor actividad. La presencia de un átomo de bromo sobre el anillo aromático no afectó significativamente a su actividad (ver Artículo 6). Comparando con el compuesto de referencia, rotenona (un potente inhibidor del complejo I, altamente tóxico), tanto las pirido[2,1-a]-IQ como las oxazino[2,3-a]-IQ mostraron actividad inhibidora de la CRM con potencias moderadas. Dado que la mayoría de inhibidores de la CRM con potenciales aplicaciones en terapéutica actúan en el rango alto nanomolar o bajo micromolar, estos compuestos ensayados, y especialmente las oxazino[2,3-a]-IQ, pueden considerarse inhibidores efectivos de la CRM. Artículo 7: “Synthesis of new antimicrobial pyrrolo [2,1-a]isoquinolin-3-ones” (En: Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20, 6589) Las pirrolo[2,1-a]isoquinoleínas (IQ), MSA poco frecuentes en la naturaleza, presentan una estructura original y han mostrado una cierta actividad antimicrobiana. La búsqueda de nuevos antibióticos y antifúngicos que puedan sustituir a fármacos poco eficaces, a causa de las resistencias generadas por los microorganismos, fue lo que nos impulsó a realizar la síntesis de nuevas pirrolo[2,1-a]-IQ con actividad antimicrobiana. Existen diversos métodos de síntesis de pirrolo-IQ. Nosotros hemos desarrollado un nuevo procedimiento basado en una doble ciclación intramolecular a partir de ?-fenilacetamidas (Figura 28). Mediante este método, las pirrolo-IQ fueron obtenidas con buenos rendimientos. Figura 28. Mecanismo de ciclación de pirrolo[2,1-a]-IQ. Utilizando este procedimiento, realizamos la síntesis de tres series de pirrolo[2,1-a]-IQ (Figura 29). Entre ellas, se sintetizó el compuesto natural trollina (3b). Figura 29. Pirrolo[2,1-a]-IQ antimicrobianas. Los 13 compuestos sintetizados fueron evaluados como bactericidas y antifúngicos, mediante la técnica de difusión en agar. En lo que respecta a los test bactericidas, nuestros compuestos fueron ensayados frentes a diversas especies bacterianas patógenas humanas: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,Enterococcus faecalis, Salmonella typhi, Escherichia coli y Erwinia carotovora. En general, pudimos observar que la introducción de un grupo lipofílico en posición 8 y/o 9 resultó adecuada para aumentar la actividad antimicrobiana, en comparación con los compuestos con hidroxilos libres en estas posiciones, como en el caso del compuesto 1b y de la trollina (3b) (Figura 29). El compuesto que presentó una actividad más relevante fue 2a, que posee un átomo de cloro en posición 8 y un grupo metoxilo en posición 9. Este compuesto demostró actividad bactericida frente a todas las cepas ensayadas. Además, mostró el mayor halo de inhibición frente a S. aureus y E. carotovora de entre todas las pirrolo-IQ sintetizadas. En el caso de esta última, la potencia bactericida de 2a fue equiparable a la del compuesto de referencia (tetraciclina). La actividad fungicida fue comprobada frente a algunas cepas de hongos fitopatógenos: Aspergillus parasiticus, Trichoderma viride, Fusarium culmorum, Geotrichum candidum y Phytophthora citrophthora. Dentro de la serie 1, las pirrolo-IQ más activas fueron 1a y su análogo fluorado 1e. Estos compuestos mostraron una potencia similar entre ellos, lo que sugiere que el grupo O-bencilo en posición 8 de las pirrolo-IQ contribuye positivamente a sus propiedades antifúngicas, independientemente de que contenga o no un grupo halógeno. El compuesto 2a, el más activo en los ensayos bactericidas, demostró un efecto antifúngico moderado.