Reprogramación directa de células somáticas adultas a células germinales meióticas

Resumen

El desarrollo de la línea germinal comienza en la especie humana durante el desarrollo embrionario con la aparición de las células germinales primordiales (CGP) desde el epiblasto proximal en la semana 2 a 3 de gestación. Las CGP migran a las crestas gonadales y cambian su perfil de expresión genético y epigenético desde un patrón somático predefinido a un patrón germinal. Durante el proceso de maduración germinal que depende del sexo del embrión, la adquisición del patrón gamético permite que células germinales puedan entrar en meiosis, un proceso crucial por el cual los gametos reducen a la mitad la carga cromosómica para, tras la fecundación, dar lugar a un nuevo individuo diploide. Sin embargo, debido a las dificultades metodológicas, éticas, morales y legales que implica su estudio durante el desarrollo embrionario humano todo nuestro conocimiento acerca del desarrollo de la línea germinal en mamíferos procede de la extrapolación del modelo murino. Por lo tanto, la generación de modelos in vitro para la derivación de células germinales humanas es de gran utilidad para estudiar tanto su desarrollo, como su biología y comportamiento. Varios estudios indican que tanto las células madre embrionarias humanas como las células madre pluripotentes inducidas humanas son capaces de mostrar un fenotipo similar al de una célula germinal tras su diferenciación llegando a mostrar marcadores meióticos y postmeióticos. Es más, recientemente se ha demostrado que células germinales inducidas in vitro a partir de hiPSC son capaces de recolonizar el nicho de las células madre espermatogoniales en ensayos de xenotransplante en ratones inmunodeprimidos. Por otra parte, la reprogramación directa de un tipo celular diferenciado a otro mediante la sobreexpresión de factores de transcripción específicos, permite plantearse la hipótesis de la reprogramación directa de células somáticas adultas hacia células germinales. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: La hipótesis de trabajo es investigar la conversión directa de células somáticas adultas a células con fenotipo germinal inducidas in vitro mediante sobreexpresión de un conjunto de genes implicados en las distintas fases del desarrollo de las células germinales. El objetivo principal es la obtención in vitro de células germinales inducidas mediante sobreexpresión ectópica de un conjunto de genes descritos como clave durante el desarrollo de la línea germinal. En base a lo anteriormente descrito, los objetivos específicos son: 1. Identificación, aislamiento y clonación en vectores lentivirales de genes humanos clave en el desarrollo de la línea germinal. 2. Optimización de las condiciones de cultivo para mejorar el mantenimiento de las células somáticas adultas humanas reprogramadas. 3. Cribado de los factores de reprogramación para encontrar la combinación más eficiente en términos de inducción y avance de la meiosis. 4. Caracterización a nivel transcriptómico y epigenético de las células germinales inducidas in vitro. 5. Análisis de la progresión meiótica y ploidía de dichas las células germinales inducidas in vitro. 6. Análisis de la funcionalidad las células germinales inducidas in vitro en modelos de xenotranplante. METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL: Se han seleccionado y clonado en vectores lentivirales los siguientes genes relacionados con diferentes fases del desarrollo de la línea germinal:- Genes inductores de la formación de células germinales 1) PRDM1: Factor de transcripción encargado de silenciar el programa somático en las CGP. 2) PRDM14: Interactúa con PRDM1 en su función y participa en la inducción del proceso de reprogramación epigenética de la línea germinal in vivo. 3) NANOS3: Relacionado con la supervivencia y el mantenimiento en estado quiescente de las células germinales mediante represión transduccional de ARNs mensajeros. 4) LIN28A: Proteína de unión al ARN encargada de silenciar varios micro ARNs y relacionada con la especificación de las CGP mediante la regulación de PRDM1. 5) NANOG: Factor de transcripción relacionado con la pluripotencia y proliferación de las CGP. Genes necesarios para la maduración y supervivencia de las células germinales: 6) DAZ2: Proteína de unión al ARN codificada en el cromosoma Y, participa de forma esencial para que se desarrolle correctamente la espermatogénesis. Su pérdida de función produce el Síndrome de sólo células de Sertoli. 7) DAZL: Proteína de unión al ARN descrita como esencial para la correcta maduración de las células germinales. Su pérdida de función produce esterilidad en ambos sexos. 8) BOLL: Proteína de unión al ARN de la misma familia que DAZ2 y DAZL, su pérdida de función produce fallos en la meiosis. 9) VASA: Proteína de unión al ARN implicada en la meiosis y maduración germinal mediante su función como regulador de los ARNs asociados a PIWI. Su pérdida de función produce esterilidad en ratones macho. 10) STRA8: Proteína implicada en la inducción de la meiosis en respuesta al ácido retinoico. Genes implicados en la meiosis: 11) DMC1: Recombinasa que se encarga de la reparación de roturas programadas en el ADN durante la recombinación de los cromosomas homólogos en la profase I de la meiosis. 12) SYCP3: Componente estructural esencial del complejo sinaptonémico durante la profase I de la meiosis. Una vez clonados, fueron transfectados en dos tipos celulares humanos primarios XY: fibroblastos de prepucio humano (hFSK de sus siglas en inglés) y células madre mesenquimales (hMSC, de sus siglas en inglés). Los días 7, 14 y 21 post-transfección, los cultivos celulares fueron analizados mediante su caracterización transcriptómica, e inmunofenotipado. Además, en el día 14, se analizó su estatus epigenético mediante secuenciación por bisulfito de dos genes improntados, su progresión meiótica y ploidía. Igualmente, 14 días después de su transfección las células germinales inducidas fueron introducidas en el testículo del ratón para el ensayo de xenotransplante. La metodología seguida se detalla a continuación: - Caracterización transcriptómica mediante array de expresión y qRT-PCR, análisis epigenético del estado de metilación por secuenciación por bisulfito, inmunofenotipado por inmunofluorescencia. - Determinación del estado meiótico mediante inmunofluorescencia para SYCP3. Determinación de la haploidía mediante separación celular activada por fluorescencia (FACS) basada en intensidad de yoduro de propidio seguido de FISH para los cromosomas 18, X, Y y recomprobado con sondas para los cromosomas 10, 12 y 3. - Para el ensayo de xenotransplante, las células transfectadas se inyectaron en el conducto eferente de ratones NUDE (Crl:NU-Foxn1nu) previamente esterilizados con busulfán, según el protocolo descrito en la literatura (Ogawa et al. 1997). Dos meses tras el xenotransplante, se analizaron los testículos de los ratones para determinar su localización y progresión. CONCLUSIONES: La sobreexpresión ectópica de un conjunto de genes reguladores del desarrollo de la línea germinal, en dos líneas celulares humanas masculinas (hFSK y hMSC) induce la aparición de una población heterogénea de células con fenotipo similar al germinal. Estas células germinales inducidas muestran un perfil de expresión y metilación compatible con el de células germinales en diferentes estadios de maduración. Algunas de estas células germinales inducidas se pueden correlacionar con un estado similar al de espermatogonia dado que son capaces de avanzar en la meiosis e incluso terminarla, dando lugar a células haploides, tras ser expuestas a ácido retinoico. La combinación más efectiva de factores para conseguir un fenotipo meiótico se disminuyó de las 12 originales a 6 incluyendo PRDM1 y PRDM14, proteínas que actúan como factores de transcripción; junto con LIN28A, DAZL y VASA, que son proteínas de unión a ARN; y SYCP3, una proteína estructural del complejo sinaptonémico. Al ser xenotransplantadas, algunas de las células germinales inducidas muestran características similares a las de células madre espermatogoniales, al demostrar su capacidad para colonizar la lámina basal de los túbulos seminíferos, probando su funcionalidad in vivo. Por lo tanto, se propone que este estudio sea considerado como un modelo piloto para el estudio in vitro del desarrollo de la línea germinal en humanos.