Estrés por disulfuro en pancreatitis aguda experimental. Implicaciones fisiopatológicas

Résumé

El estrés oxidativo se define como la alteración en el equilibrio entre las especies oxidantes y antioxidantes, a favor de las primeras. Mientras que hay muchos tipos de daño oxidativo, cada vez más pruebas sugieren un papel importante en la oxidación de proteínas en múltiples enfermedades. Los puentes disulfuro se forman en el citosol durante el estrés oxidativo y funcionan como intercambiadores redox. El glutatión es un tripéptido y es uno de los principales antioxidantes, lo que le confiere un papel clave en numerosas funciones celulares. El estado redox del glutatión se considera el mejor indicador de estrés oxidativo en las células, ya que refleja el equilibrio entre el estado antioxidante y las reacciones pro-oxidantes. Hoy en día, la pancreatitis aguda es una enfermedad relativamente común. Sin embargo, las principales cuestiones que plantean tanto los médicos y los investigadores siguen sin respuesta. ¿Cómo podríamos diagnosticar la pancreatitis aguda antes? ¿Qué tratamiento hay que dar a un paciente para atenuar el proceso inflamatorio? ¿Cuál es el período de tiempo que nos podemos permitir entre que los datos del paciente son tomados y el diagnóstico de la pancreatitis aguda? Con el fin de responder a estas preguntas, es necesario conocer los mecanismos moleculares que ocurren durante el desarrollo de la respuesta inflamatoria del páncreas. Por estas razones, uno de los objetivos de esta Tesis ha sido analizar el estado redox de los tioles y los disulfuros mixtos y de identificar dianas de señalización redox en páncreas en la pancreatitis aguda experimental como modelo de inflamación aguda asociada con la depleción de glutatión. Existen diferentes modelos experimentales para inducir y estudiar la pancreatitis aguda en los animales, todos caracterizados y bien establecidos para inducir la pancreatitis aguda leve y grave. Para el desarrollo de esta Tesis, se ha utilizado un modelo de pancreatitis aguda necrótica inducida por la infusión retrógrada de taurocolato sódico en ratas. Este modelo tiene una alta reproducibilidad y ha sido utilizado por nuestro grupo de investigación durante varios años. Además, se ha utilizado un modelo in vitro a través de una línea celular de células acinares pancreáticas (266-6) procedentes de ratones para investigar en mayor profundidad los mecanismos implicados. Por lo tanto, para el estudio de la pancreatitis aguda se utilizaron tanto modelos in vitro como in vivo. Se sabe que existe una asociación entre la inflamación aguda y la depleción de glutatión reducido (GSH). Además, la depleción de GSH en el páncreas es una característica distintiva de las primeras fases de la pancreatitis aguda y contribuye a la severidad de la enfermedad. Uno de los objetivos de esta Tesis ha sido caracterizar las consecuencias de la depleción de GSH en la pancreatitis aguda a nivel molecular. La depleción de glutatión en el páncreas en la pancreatitis aguda no está asociada a ningún aumento en los niveles de glutatión oxidado o glutationilación de proteínas. Los niveles de cistina y homocisteína, así como la cisteinilación y ?-glutamilcisteinilación de proteínas aumentaron notablemente en el páncreas después de la inducción de la pancreatitis. La cisteinilación de proteínas fue indetectable en el páncreas en condiciones basales. La cuantificación de estos tioles de bajo peso molecular, sus formas reducidas y oxidadas, así como los puentes disulfuro mixtos (formas unidas a proteínas) se llevó a cabo en muestras de tejido pancreático fresco de rata y el posterior análisis por espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-MS/MS). Para evaluar la formación de puentes disulfuro durante el curso de la pancreatitis aguda, se llevó a cabo un intercambio redox con monobromobimano. El aumento de la fluorescencia después de la aparición de la pancreatitis mostró que la oxidación reversible de tioles se forma en el curso de la enfermedad. Tras confirmar la formación de puentes disulfuro durante la pancreatitis aguda, se investigó si los puentes disulfuros se formaban con tioles libres de bajo peso molecular, tales como GSH, cisteína, etc, o entre las proteínas. La mayoría de los disulfuros que sufren las proteínas parece ser debido a la unión de tioles de bajo peso molecular ya que la electroforesis diagonal llevada a cabo después del intercambio redox con biotina reveló un marcado aumento de quimioluminiscencia a lo largo de la diagonal a las 6h tras la inducción de la pancreatitis aguda. Después de estudiar la formación de puentes disulfuro en la pancreatitis aguda, se evaluaron otras modificaciones oxidativas de las proteínas: La S-nitrosilación y la carbonilación. La S-nitrosilación se evaluó mediante el intercambio con biotina y la carbonilación por electroforesis bidimensional utilizando un anticuerpo contra residuos carbonilados. No hubo cambios significativos en la S-nitrosilación y carbonilación de proteínas durante el curso de la pancreatitis aguda. Por tanto, en la presente Tesis mostramos que la pancreatitis aguda es una patología inflamatoria asociada con el estrés oxidativo, pero en la que no aparece carbonilación ni S-nitrosilación de proteínas y sin embargo, se acompaña de una considerable formación de puentes disulfuro. Los intercambios tiol-disulfuro en las proteínas pueden causar grandes efectos sobre la actividad de las mismas y sobre la señalización celular. En esta Tesis, se describe el estrés por disulfuro como un tipo de estrés oxidativo que ocurre en la inflamación aguda en mamíferos y que está asociado con la oxidación del par cisteína/cistina y la cisteinilación de proteínas, pero sin cambios en la oxidación del glutatión o en la glutationilación de proteínas. El siguiente paso en esta Tesis fue identificar dianas de estrés por disulfuro y que por tanto se oxidan en el curso de la pancreatitis aguda. Las dianas de estrés por disulfuro se identificaron mediante diferentes técnicas: Western blotting en condiciones reductoras y no reductoras, electroforesis diagonal, métodos proteómicos y el estudio de la actividad fosfatasa en presencia y ausencia de N-acetilcisteína. Todas las dianas potenciales de estrés por disulfuro que se estudiaron en la presente Tesis fueron escogidas por su importancia y relevancia particular en su implicación en la estabilidad redox, la señalización redox y la cascada inflamatoria que se produce en la pancreatitis aguda. El estudio de las proteín fosfatasas en esta Tesis permitió una elucidación adicional de los mecanismos implicados en el proceso inflamatorio durante la pancreatitis aguda así como la identificación de proteín fosfatasas como dianas de estrés por disulfuro. Todas las dianas identificadas de estrés por disulfuro se pueden clasificar en dos grupos: Los tampones redox y los tioles de señalización redox. Los tampones redox incluyen el inhibidor de la ribonucleasa y la albúmina. Los tioles de señalización redox son la tiorredoxina 1, APE1/REF1, KEAP1, las tirosín fosfatasas, las serín/treonín fosfatasas y la proteína disulfuro isomerasa. Estas dianas de estrés por disulfuro presentan gran relevancia en los procesos biológicos que implican actividad enzimática, la reparación del ADN, la proliferación celular, la apoptosis, el estrés del retículo endoplasmático y la respuesta inflamatoria. El estrés por disulfuro sería por tanto un tipo específico de estrés oxidativo implicado en la señalización redox en mamíferos. Debido a su relación con el estrés oxidativo, la homeostasis redox, y su acción sobre las MAPKs, la PP2A podría desempeñar un papel clave en las fases tempranas de la pancreatitis aguda, particularmente en la forma grave de la enfermedad, participando críticamente en el control en cascada inflamatoria. Sobre la base de esta hipótesis, así como en la oxidación observada en la subunidad catalítica de la PP2A y su pérdida de actividad en la pancreatitis aguda, decidimos silenciar la PP2Ac en células acinares pancreáticas 266-6 con el fin de estudiar el papel de la inactivación de la PP2A en la activación de la cascada de MAPK y en la regulación de las citoquinas inflamatorias. Además, las células acinares pancreáticas 266-6 silenciadas y no silenciadas la PP2Ac, se incubaron con 10 ng/mL de TNF-? durante 1 h. Y, con el fin de simular in vitro las condiciones del modelo experimental in vivo inducido por taurocolato sódico, las células acinares pancreáticas 266-6 silenciadas y no silenciadas la PP2Ac fueron tratadas con taurocolato sódico al 0,5% durante 2 h. A continuación, la expresión del ARNm de los genes il-6, cxcl1 y tnf-? se evaluó mediante PCR en tiempo real. El silenciamiento in vitro de la PP2Ac en células acinares pancreáticas conduce a la activación de las MAPKs p38 y JNK y a la regulación de las citoquinas CXCL-1, IL-6 y TNF-?. Todos estos hallazgos podrían ayudar a entender mejor la base molecular de la enfermedad pancreática y a las principales dianas de estrés oxidativo que se ven afectadas durante la pancreatitis aguda. El conocimiento de la biología molecular de una enfermedad es importante porque, en última instancia, tiene su expresión a nivel macromolecular. Las dianas identificadas y el estudio de la respuesta antioxidante e inflamatoria también pueden contribuir a mejorar el tratamiento terapéutico de la pancreatitis aguda. Por otra parte, el nuevo mecanismo que está implicado en la inflamación aguda en mamíferos proporcionaría una nueva herramienta para el estudio de otras enfermedades en las que la inflamación está presente.