Análisis funcional de Cabut, un factor de transcripción implicado en el cierre dorsal de Drosophila

Resumen

El cierre dorsal (CD) es uno de los últimos procesos morfogenéticos que ocurre durante la embriogénesis en Drosophila y consiste en el cierre del agujero más dorsal que presenta el embrión durante el estadio 13 de su desarrollo. Para ello, las capas epiteliales laterales migran sobre la amnioserosa (AS), un epitelio que recubre el vitelo formando el agujero dorsal, para finalmente fusionarse y formar una capa epitelial continua (Bate y Martínez-Arias, 1993). Este proceso necesita de la coordinación de la epidermis, la AS y el vitelo, así como de reestructuraciones en el citoesqueleto celular, la polarización de las células epidérmicas más dorsales (CMD), la formación de filopodios y lamelipodios y la activación de rutas de transducción de señal como la de las kinasas N-terminales de Jun (JNKs) (Riesgo-Escovar et al., 1996). El CD es el proceso más estudiado de la extensión y fusión de epitelios y comparte muchas similitudes con el proceso de curación de heridas en vertebrados (Kiehart, 1999; Jacinto y Martin, 2001; Jacinto et al., 2001). cabut (cbt), es un gen que se caracterizó a nivel genético y molecular en nuestro laboratorio y que codifica un factor de transcripción necesario para que se produzca el CD. Numerosos ensayos han demostrado que cbt se expresa en la epidermis y el vitelo actuando bajo el control de las JNKs y regulando la expresión del gen decapentaplegic (dpp) en el leading edge (LE) (región frontera entre la amnioserosa y las células epidérmicas más dorsales) (Muñoz-Descalzo et al., 2005). Además proteínas ortólogas a Cbt han sido identificadas en organismos invertebrados y vertebrados. En el caso de vertebrados, estas proteínas pertenecen a la familia de factores de transcripción TIEG (del inglés TGF-inducible early gene) (Muñoz-Descalzo et al., 2007), que han sido descritos como inhibidores de la proliferación celular y asociados a diferentes tipos de procesos cancerosos como el cáncer de páncreas (Cook et al., 1999; Ellenrieder et al., 2002). Trabajos independientes relacionan a Cbt con otros procesos como el ciclo circadiano (Kadener et al., 2007), la regeneración de discos imaginales (Blanco et al., 2010), el control del ciclo celular (Katzaroff et al, en preparación), el crecimiento celular (Guertin et al., 2006; Bülow et al., 2010), la remodelación neuroendocrina y la respuesta a la ecdisona (Beckstead et al., 2005; Zhao et al., 2008) la guía de axones y sinaptogenesis (Kraut et al., 2001; Mindorff et al., 2005). El estudio a nivel funcional de la proteína Cbt es de sumo interés, puesto que el conocimiento de cómo se regula su función y cuáles son sus dianas transcripcionales durante el CD permitirán aumentar el conocimiento de cómo se regula este proceso. Además la localización de la proteína en los diferentes tejidos/sistemas durante el desarrollo de Drosophila, puede confirmar y ampliar el conocimiento de la contribución de Cbt en otros procesos. Por todo ello, en esta tesis doctoral se han generado diferentes herramientas genéticas, bioquímicas e inmunológicas para poder realizar diferentes aproximaciones que nos lleven a dilucidar estos paradigmas. En concreto, para determinar cuáles son las dianas transcripcionales de Cbt durante el CD, se generó un anticuerpo que reconoce de forma específica a Cbt para poder realizar ensayos de Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP-on-chip) Esto ha permitido realizar un estudio amplio del patrón de expresión embrionario de la proteína, tanto durante el CD como en otros estadios del desarrollo. La utilización de técnicas inmunohistoquímicas en embriones ha permitido describir que Cbt no solo se expresa en los núcleos de la epidermis, el vitelo y el intestino posterior durante el CD, sino también en los núcleos de la AS.. La expresión de Cbt en este tejido también depende de la ruta de las JNKs y es esencial para este proceso. Aprovechando esta metodología se han descrito nuevos patrones de expresión de Cbt en embriones tempranos, y en el sistema nervioso central y periférico embrionario-larvario sugiriendo nuevas funciones de esta proteína (Belacortu et al., 2011). Mediante ensayos en cultivo celular se ha determinado que la señal de transporte al núcleo de Cbt se encuentra en el extremo amino terminal y corresponde a la secuencia 71PNKKPRL77, siendo imprescindibles para este transporte las lisinas K73K74. Esta secuencia está conservada en insectos pero no en las proteínas TIEG, donde aunque sea funcional, ha sido sustituida por una secuencia contenida dentro de los dominios de los dedos de zinc tipo C2H2 (Spittau et al., 2007). Además, se ha podido determinar que, al igual que las proteínas TIEG, Cbt puede actuar como activador y/o represora de la transcricpión. Por último, se han realizado análisis de expresión diferencial con microarrays en embriones mutantes cbt durante el CD, así como análisis de ChIP-on-chip utilizando el anticuerpo anti-Cbt. A partir de los resultados obtenidos hemos demostrado que la expresión de Cbt en la epidermis está regulado por la ruta de señalización de la hormona ecdisona y que, a su vez, Cbt regula la expresión de más de 1000 genes entre los que se encuentran Tm2, InR, fas y los genes inducibles por ecdisona ImpE1 e ImpL1. Asímismo, los ensayos de ChIP-on-chip han mostrado que Cbt es capaz de unirse a varias regiones genómicas entre las que se encuentran su propio promotor y el promotor del gen NPC1a, implicado en el tráfico de lípidos. En conjunto, estos resultados apoyan la idea de que la ecdisona está implicada en el CD, probablemente a través de Cbt, y sugieren que el transporte de lípidos podría tener un papel importante en el mismo.