Estudio de la expresión génica de diversos componentes del sistema fibrinolítico de las metaloproteasas y de la angiogénesis en la endometriosis. Correlación de los niveles de expresión con algunos polimorfismos estudiados

Resumen

INTRODUCCIÓN: La endometriosis, definida como la presencia de tejido endometrial fuera del útero, es una de las enfermedades ginecológicas benignas más frecuentes. La endometriosis es una entidad multifactorial y poligénica en la que tanto factores endometriales como peritoneales, relacionados con los sistemas de activación del plasminógeno (PA) y de las metaloproteasas (MMPs) y la angiogénesis, pueden estar implicados en esta enfermedad. OBJETIVO: Analizar los niveles de mRNA y proteína de factores angiogénicos (factor de crecimiento del endotelio vascular, VEGF-A y trombospondina-1, TSP-1) y componentes de los sistemas PA (uroquinasa, uPA; inhibidor del PA tipo 1, PAI-1) y de las MMPs (MMP-3; inhibidor de MMPs de tipo 1, TIMP-1) en tejido endometriósico y endometrio de mujeres con y sin endometriosis. También se estudiaron los niveles proteicos de estos componentes en el líquido peritoneal (LP) de pacientes y controles. Por otra parte, se estudiaron los polimorfismos 4G/5G del gen del PAI-1, 5A/6A del gen de la MMP-3 y tres polimorfismos funcionales del gen del VEGF-A (-460C/T, +405G/C y 936C/T) en pacientes y controles y se analizó la influencia de estos polimorfismos en la expresión de PAI-1, MMP-3 y VEGF-A en tejido endometrial y LP. Por último, se evaluó la influencia del LP sobre la expresión de factores proteolíticos y angiogénicos en cultivos de células endometriales procedentes de pacientes y controles. MÉTODOS: Los niveles de mRNA se cuantificaron mediante qRT-PCR en tiempo real y los niveles proteicos mediante ELISA. El polimorfismo 4G/5G del gen del PAI-1 se evaluó mediante PCR con cebadores específicos de alelo. El polimorfismo 5A/6A de la MMP-3 y los polimorfismos del VEGF-A se determinaron mediante PCR-RFLP. Por último, se aislaron y cultivaron células endometriales (de pacientes y controles) y se trataron con LP de pacientes y controles. Posteriormente, se evaluaron los niveles de mRNA y proteína de los factores estudiados. RESULTADOS y CONCLUSIONES: El endometrio y el LP de las mujeres con endometriosis mostró unos niveles de uPA, MMP-3 y VEGF-A superiores a los controles. Este incremento puede facilitar la adhesión del tejido endometrial al peritoneo y ovario, la invasión de la matriz extracelular y la angiogénesis, contribuyendo a la formación de las lesiones endometriósicas tempranas. El tejido endometriósico ovárico mostró unos niveles superiores de PAI-1, TIMP-1 y TSP-1 que el endometrio, lo que podría explicar la presencia del quiste endometriósico con ausencia de invasión al tejido ovárico adyacente. Las frecuencias genotípicas y alélicas del polimorfismo 4G/5G del gen del PAI-1 no difieren entre pacientes y controles, aunque los niveles de PAI-1, en tejido endometrial y LP de controles, parecen estar asociados con este polimorfismo. Las pacientes mostraron una mayor frecuencia del alelo 936T, del gen del VEGF, que los controles. Sin embargo no se encontraron diferencias en la distribución de frecuencias genotípicas y alélicas en los otros dos polimorfismos del VEGF-A (-460C/T, +405G/C) entre pacientes y controles. Estos hallazgos sugieren que el polimorfismo 936C/T puede estar asociado con el riesgo de padecer endometriosis, aunque el incremento en los niveles de VEGF-A, observado en las mujeres con endometriosis, no parece estar asociado con ninguno de los polimorfismos estudiados. Por último, el LP de las mujeres con endometriosis indujo un incremento en los niveles de uPA y VEGF-A en cultivos de células endometriales de pacientes y controles. Los mayores niveles de uPA y VEGF-A se observaron en cultivos de células endometriales de pacientes tratados con LP de mujeres con endometriosis. Por tanto, el LP induce, en las células endometriales, una mayor expresión de factores proteolíticos y angiogénicos que pueden contribuir al desarrollo de las lesiones endometriósicas. INTRODUCTION: Endometriosis, defined as the presence of endometrium outside the uterus, is one of the most frequent benign gynaecological diseases. It is a multifactorial and polygenic entity in which both endometrial and peritoneal factors, related to plasminogen activator and matrix metalloproteinase systems and angiogenesis, can be implicated. OBJETIVE: To analyze mRNA and protein levels of angiogenic and proteolytic factors in endometriotic and endometrial tissues from patients and controls. The protein levels were also studied in peritoneal fluid (PF). PAI-1 4G/5G, MMP-3 5A/6A and VEGF-A -460C/T, +405G/C and 936C/T polymorphisms were evaluated. Finally, the influence of PF on proteolytic and angiogenic factor expression in endometrial cell cultures (ECCs) was evaluated. METHODS: mRNA and protein levels were quantified by real-time qRT-PCR assay and ELISA, respectively. PAI-1 4G/5G polymorphism was determined by allele-specific PCR. MMP-3 5A/6A and VEGF polymorphisms (-460C/T, +405G/C, and 936C/T) were determined using a PCR-RFLP assay. Finally, ECCs were treated with PF from patients and controls. RESULTS and CONCLUSIONS: Endometrium and PF from patients showed higher uPA, MMP-3 and VEGF-A levels than controls. This increase may facilitate the attachment of endometrial tissue to the peritoneum and ovarian surface. This process would lead to the formation of early endometriotic lesions. Ovarian endometrioma had higher PAI-1, TIMP-1 and TSP-1 levels than endometrium, which could explain the finding of one endometrioma without adjacent tissue invasion. The PAI-1 4G/5G genotypes and allele frequencies did not differ between patients and controls. However, endometrial and peritoneal PAI-1 levels seem to be associated with PAI-1 4G/5G polymorphism in controls. Patients showed a higher VEGF 936T allele frequency than controls. These findings suggest that the VEGF 936C/T polymorphism may be associated with the risk of endometriosis. Finally, PF induced an increase in uPA and VEGF-A levels in ECCs. The highest levels were observed in ECCs from patients with endometriosis treated with PF from women with endometriosis. So, PF induces a higher expression of proteolytic and angiogenic factors in EECs, which could contribute to the development of endometriotic lesions.