Estrategias para mejorar la calidad de las separaciones en cromatografía líquida de fase inversa

Resumen

La Memoria de Tesis Doctoral propone estrategias dirigidas a mejorar la separación de mezclas que muestran una resolución cromatográfica extraordinariamente baja, en las condiciones usuales de elución, mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, high-performance liquid chromatography). La HPLC es actualmente la técnica analítica de separación más extendida, debido a su amplio campo de aplicación, fiabilidad, robustez y sensibilidad. Lamentablemente, la eficacia que proporciona suele ser inferior a la conseguida en cromatografía de gases, electroforesis capilar y otras técnicas de electromigración, lo que representa una limitación para el análisis de muestras complejas. Los estudios incluidos en la Memoria se han centrado, principalmente, sobre aspectos teóricos fundamentales de interés general en HPLC utilizando elución isocrática y en gradiente, con columnas individuales o acopladas, relacionados con la predicción de las condiciones de elución, la modelización de picos cromatográficos, la investigación de los mecanismos de retención que existen en el interior de las columnas cromatográficas cuando se establecen equilibrios secundarios en presencia de diversos tipos de aditivos añadidos a las fases móviles (los surfactantes dodecilsulfato sódico y polioxietilen(23)lauril éter, líquidos iónicos derivados del 3-metilimidazolio y las aminas trietilamina y dimetiloctilamina), y la combinación de mecanismos de separación. En esta última serie de investigaciones, deben resaltarse contribuciones novedosas sobre la correcta conexión de columnas cromatográficas en HPLC, y el desarrollo de herramientas quimiométricas para la predicción y optimización de cromatogramas cuando se utilizan columnas acopladas en elución isocrática y de gradiente. También, con el fin de describir de una manera sencilla y global el comportamiento de mezclas de solutos en diversas condiciones, utilizando ambos tipos de elución, cabe destacar el desarrollo de gráficos que proporcionan información global sobre la retención o sobre la cinética de las interacciones soluto-fase estacionaria. Otras aportaciones se refieren a la propuesta de diversas metodologías para monitorizar la posible adsorción de un aditivo sobre la fase estacionaria, favorecer la inyección directa de muestras fisiológicas en una columna cromatográfica y realizar la correcta medida de la supresión de la actividad de los grupos silanol en las columnas de base sílice mediante la adsorción de aditivos añadidos a la fase móvil. Las investigaciones se llevaron a cabo con compuestos de diversa naturaleza (sulfonamidas, ? bloqueantes, diuréticos y flavonoides), eluidos con mezclas de acetonitrilo-agua en presencia y ausencia de diversos aditivos, así como fases móviles micelares que sólo contenían un surfactante en ausencia de disolvente orgánico. Para realizar los estudios, se han utilizado columnas cromatográficas de fase inversa de diverso tipo: C18 convencionales y con grupos embebidos para modificar su polaridad, ciano y fenilo. En los diversos estudios, se han desarrollado softwares de optimización basados en la modelización tanto del tiempo de retención como del perfil de los picos cromatográficos, para elución isocrática y de gradiente, utilizando gráficos de Pareto para encontrar soluciones que proporcionen resoluciones y tiempos de análisis aceptables, y algoritmos genéticos para reducir el tiempo de cálculo.