Transferencia génica hepática hidrodinámica en modelos de cerdo in vivo y segmento humano ex vivo

Resumen

Introducción: La terapia génica es una estrategia terapéutica que pretende utilizar ácidos nucleicos como medicamentos para el tratamiento temporal o permanente de patologías hereditarias o adquiridas. En base al vehículo utilizado para entregar el gen, podemos clasificar la terapia génica en dos grupos: la terapia génica viral (vectores virales) y la terapia génica no viral (vectores no virales o ADN desnudo). La terapia no viral resulta menos eficiente pero más segura. La hidrofección (transferencia génica hidrodinámica) ha mostrado un gran potencial, con resultados terapéuticos en ratón. Sin embargo, cuando la hidrofección se ha trasladado a animales de mayor tamaño, el procedimiento ha mostrado baja eficacia. Quedan por resolver los motivos de esta ineficiencia. Desarrollo: la presente tesis tiene como objetivo confirmar o refutar el potencial interés traslacional de la hidrofección en base a un análisis molecular cuantitativo del proceso de decodificación genética del gen transfectado (eGFP, hAAT y hIL10) en tejido. Además, se evalúa el mecanismo del proceso de entrega génica mediante el análisis ultraestructural del tejido transfectado con nanopartículas de oro (4-15 nm de diámetro). Para ello, se han desarrollado 3 modelos de transferencia génica hepática: 1) modelo quirúrgico en cerdo con cierre vascular hepático completo; 2) modelos de cateterismo endovascular sin cierre (abierto) o con cierre (cerrado) de la vena porta y 3) modelo de segmentos hepáticos humanos estancos procedentes de resecciones quirúrgicas. La entrega y transcripción del gen se evalúan como número de copias por célula mediante PCR cuantitativa, utilizando una curva patrón preparada con el propio gen. La expresión de la proteína se determina en tejido de manera semicuantitativa (Fluorescencia, Western Blot, Inmunohistoquimia) y cuantitativa (ELISA), y se expresa como número de copias por célula. En sangre la proteína se determina mediante ELISA. Los resultados en cerdo muestran que la hidrofección media una entrega génica igual o superior a la del patrón oro (modelo murino) y una traducción proteica en tejido (directamente proporcional al grado de cierre vascular del órgano) similar a éste y al humano. Sin embargo, los niveles plasmáticos de la proteína son claramente inferiores a los esperados en base a la cantidad presente en el tejido. En los experimentos con segmentos humanos, la hidrofección media una traducción de la proteína en tejido de 100-1.000 copias por célula. La interpretación ultraestructural del proceso de entrega génica se lleva a cabo mediante inyección hidrodinámica de nanopartículas. El estudio por microscopía electrónica muestra que las partículas pequeñas tienen fácil acceso al núcleo mientras que partículas de mayor tamaño sólo son observadas en el interior de vesículas de células con actividad fagocítica pero no en el citoplasma del hepatocito. Conclusión: 1. La eficiencia está directamente relacionada con el grado de cierre vascular del órgano. 2. Condiciones de perfusión violentas conducen a resultados más pobres y más riesgos para el paciente. 3. No se requiere una entrega génica muy elevada para una traducción eficiente de la proteína. 4. En el modelo porcino, existe dificultad de exportar la proteína humana traducida al torrente sanguíneo. 5. Los resultados obtenidos en segmentos humanos confirman la eficiencia de traducción de la proteína y el potencial interés traslacional del procedimiento. 6. La entrega génica a los hepatocitos se verifica por un proceso de difusión a través de la membrana sin solución de continuidad de la misma. 7. Las membranas del tejido hepático limitan el acceso de partículas al núcleo, estando el diámetro máximo permitido cercano a los 4 nm. De las conclusiones parciales enumeradas se deduce que la hidrofección hepática es un procedimiento de transferencia génica seguro y eficiente con gran potencial de interés clínico traslacional