Sistemas de dos componentesbúsqueda de inhibidores, caracterización estructural y nuevos mecanismos de señalización

Resumen

El objetivo de este trabajo es el estudio de las bases bioquímicas y estructurales de la transducción de la señal mediada por los sistemas de dos componentes (TCS), así como, su inhibición y modulación. En la última mitad de los años ochenta emergió el término dos componentes para describir una nueva clase de sistemas de transducción de señal encontrados en bacterias. En la actualidad, cientos de estos sistemas han sido descritos en eubacterias, arqueobacterias y en menor medida en eucariotas (plantas y levaduras) (Nixon et al., 1986). Los sistemas de dos componentes (TCS) responden a múltiples estímulos, controlando a su vez una amplia variedad de procesos esenciales para la célula como quimostasis, ciclo celular, esporulación, relacionados con la virulencia, y la resistencia a antibióticos. El sistema prototipo consta de dos componentes centrales: Una proteína histidina quinasa (HK) y una proteína reguladora de la respuesta (RR). En general, la química de la transducción de señal en un sistema básico de dos componentes incluye tres reacciones: la llegada de un estímulo modula la autofosforilación en un residuo de histidina específico de una HK dímerica, posteriormente este mismo grupo fosforilo es transferido a un aspartato del correspondiente RR, y finalmente el RR se defosforila, bien por un actividad fosfatasa intrínseca o bien inducido por la HK. El nivel de fosforilación del RR altera sus propiedades transcripcionales, enzimáticas o mecanísticas y por lo tanto el output del sistema . La amplia mayoría de las HKs constan de dos partes funcionales y estructurales: una región variable extracelular N-terminal sensora (Nt) encargada de percibir la señal o estímulo y una región citoplasmática catalítica conservada C-terminal (Ct) formada por el dominio de dimerización (llamado) DHp y el dominio que une ATP (llamado CA). A nivel de estructura cuaternaria, las HKs se encuentran como homodímeros. Por su parte, los RRs suelen contener dos dominios funcionales: un dominio aceptor altamente conservado donde se aloja el aspártico que se fosforila y un dominio efector. La mayor parte de los dominios efectores tienen capacidad de unión a ADN actuando como factores de transcripción, aunque otros son enzimas y algunos carecen de este dominio efector. Los TCS han estado sujetos a numerosos estudios bioquímicos y estructurales desde el momento de su descubrimiento. Su carácter modular ha facilitado el estudio estructural de los dominios catalíticos de las HKs y los RRs de forma individual. Sin embargo, y debido a la caracterización de dominios aislados, no tenemos información estructural de las reacciones catalizadas por las proteínas del sistema. Recientemente se ha resuelto por el grupo, la estructura de la porción citoplasmática completa que incluye los dominios DHp y CA de la HK TM0853 de Thermotoga marítima. Dicha estructura ha proporcionado la primera imagen de la porción citoplasmática completa de una HK ortodoxa y los contactos entre los dominios catalíticos DHp y CA. Sin embargo, todavía existe poca información estructural de las reacciones que catalizan tanto la HK como el RR, así como de la formación de su complejo. Las enfermedades infecciosas son la primera causa de mortalidad en el mundo, a pesar del gran armamento de agentes antimicrobianos desarrollados durante el último medio siglo. Las bacterias son organismos con una alta capacidad de adaptación emergiendo de forma continua cepas resistentes a los agentes antibacterianos, proceso catastrófico cuando hablamos de algunos tipos de bacterias. Por lo tanto, la búsqueda de nuevos agentes antibacterianos contra nuevas dianas, no es solo un proceso continuo, sino necesariamente urgente. Como antes hemos dicho, los TCS están relacionados con procesos de virulencia y resistencia a antibióticos, por lo que estos sistemas constituyen una excelente diana para la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos. Es obvio que esta circunstancia no ha pasado desapercibida para la industria farmacéutica que ha gastado grandes sumas de dinero en la búsqueda de inhibidores para estos sistemas, habiéndose desarrollado diferentes familias de compuestos con alta actividad inhibitoria, aunque su mecanismo de acción esta mal caracterizado y es muy inespecífico, hechos que han impedido su uso terapéutico (Stephenson, K., Yamaguchi, Y. and Hoch, J.A. (2000) J. Biol. Chem. 275: 38900-38904), debido al desconocimiento del mecanismo molecular de su inhibición, además de presentar múltiples efectos secundarios. El análisis de datos estructurales existentes, de estos TCS, nos informará sobre las regiones de máxima especificidad y potencialidad de los inhibidores, y nos permitirá el rediseño de nuevas drogas más específicas. Además de en bacterias, estos TCS, también se han encontrado en otro tipo de microorganismos, como son las cianobacterias. Las cianobacterias son procariotas fotosintéticos que realizan en plantas un tipo de fotosíntesis oxigénica. La supervivencia de estos microorganismos de vida libre en un entorno cambiante depende de su capacidad para modular el metabolismo celular de acuerdo a las condiciones externas para modificar la composición de la maquinaria fotosintética en repuesta a los cambios producidos en el medio ambiente (Grossman y cols., 1993). Un espectacular ejemplo de esta adaptación es el proceso de clorosis, en el que las cianobacterias no diazotróficas degradan sus ficobilisomas, cuando son expuestas a condiciones de estrés, tales como falta de nutrientes (Collier y Grossman, 1992). La pérdida de ficobilisomas y la reducción en el contenido de clorofila durante estas condiciones de estrés son las responsables de la aparición de una coloración amarilla en las poblaciones de cianobacterias. La degradación de los ficobilisomas evita la absorción excesiva de energía de excitación, y de los suministros de las células con aminoácidos necesarios para la síntesis de las proteínas necesarias para la aclimatación y la supervivencia celular (Grossman y cols., 2001). En synechococcus sp. PCC 7942, exámenes genéticos no derivados de blanqueamiento, permitió la identificación de los defectos de los mutantes en el proceso de clorosis. Las funciones específicas incluyen una pequeña proteína NblA, uno de los principales efectores del proceso de blanqueado, y otras tres proteínas con diferentes funciones en este proceso: el regulador de la respuesta NblR, de la familia OmpR/PhoB (Schwarz y Grossman, 1998), una histidina quinasa sensora NblS (Van Waasbergen et al. 2002), y , más recientemente, el factor NblC de la familia SpoIIAB (Sendersky et al ., 2005). A pesar del hecho de que NblS y NblR fueron identificados como histidina quinasa y su regulador, no existe ninguna prueba directa de las interacciones entre ellos, y se sabe muy poco de sus mecanismos de acción. Estudios de doble híbrido en Synechococcus dieron como resultado la identificación de una nueva proteína llamada SipA, que se une a la región c-terminal de NblS. La fuerte y específica interacción entre SipA y NblS , conservando intacto el dominio de unión a ATP, la distribución filogenética de los genes de SipA y NblS y la inferencia de co-evolución de esta interacción en cianobacterias, llevó a sugerir un papel conservado en la adaptación para SipA de la maquinaria fotosintética en condiciones de estrés (Espinosa et al., 2006). En esta tesis se presenta el siguiente trabajo: - Cristalización y resolución de la estructura, por difracción de rayos X, de la proteína SrrB, una histidina quinasa de Staphylococcus aureus, utilizando la técnica de dispersión anómala a diferentes longitudes de onda (MAD). Hasta el momento es la segunda estructura tridimensional de un dominio citoplasmático completo de una histidina quinasa. - Búsqueda de nuevos inhibidores de histidina quinasas mediante técnicas in silico e in vitro, así como resolución de estructuras que contengan dichos compuestos con el fin de estudiar sus interacciones y diseñar un mejor inhibidor. - Estudio de la función y participación en un sistema de dos componentes de NblS, una histidina quinasa encontrada en Cianobacterias. - Estudio de la función de SipA en los TCS y de su modulación con respecto a NblS. - Búsqueda del regulador de la respuesta de NblS mediante ensayos enzimáticos clásicos, y estudio de su función dentro de este sistema de dos componentes. - Mediante ensayos bioquímicos y de biología molecular se descarta a NblR como regulador de la respuesta de NblS, como hasta este momento se proponía. - Mediante estudios bioquímicos, de autofosforilación con pequeños donadores y ensayos enzimáticos clásicos, demostración de que NblR es un regulador de la respuesta atípico. - Búsqueda de la secuencia de ADN a la cuál se une NblR para llevar a cabo su función, mediante ensayos de movilidad electroforética.