Hacia la caracterización del epítopo del autoantígeno en el Síndrome de Goodpasture

Resumen

El síndrome de Goodpasture (GP) es un desorden autoinmune que cursa con glomerulonefritis rápidamente progresiva y hemorragia pulmonar. El ataque inmunológico se lleva a cabo mediante (auto)-anticuerpos (anticuerpos GP) dirigidos contra el dominio C terminal, no colagenoso (NC1), de la cadena ?3 del colágeno IV, presente en la membrana basal glomerular (GBM), así como en la membrana basal alveolar. Tres cadenas ? se asocian para construir una molécula de colágeno IV, que recibe el nombre de protómero, dos protómeros de colágeno IV se unen a través de sus extremos NC1 para formar una estructura cuaternaria de naturaleza hexamérica (hexámero) en la red de colágeno IV. Estudios cristalográficos han mostrado que en la estabilización del hexámero participan tanto interacciones hidrofóbicas, como interacciones hidrofílicas que junto con enlaces covalentes tipo sulfilimina entre protómeros opuestos sellan el hexámero. Lo que se conoce del epítopo GP son dos regiones, llamadas EA y EB, en las que se identificaron los residuos Ala18, Ile19, Val27 y Pro28 conformando parte del epítopo patogénico. Así, éste parece ubicarse en la interfaz de los dominio NC1 que forman el hexámero de la red de colágeno de la GBM, resultando en un epítopo críptico e inaccesible para los anticuerpos GP. Cuando se disocia el hexámero, estos aminoácidos se tornan accesibles a los anticuerpos GP. En contraste, otros residuos que forman parte del epítopo, como los residuos hidrofílicos Ser21 y Ser 31, así como la Pro28, son accesibles a los anticuerpos GP tanto si el dominio NC1 se encuentra en forma hexamérica como monomérica. Un aspecto relevante en la enfermedad GP, es el mecanismo mediante el cual los autoanticuerpos tienen acceso al epítopo. En este sentido, la proteína de unión al antígeno GP (GPBP) podría jugar un papel clave en el plegamiento de las cadenas de colágeno IV condicionando la diferente accesibilidad del antígeno GP. Objetivos El objetivo general de este trabajo persigue esclarecer la etiología de la enfermedad Goodpasture y profundizar en el conocimiento del epítopo de los autoanticuerpos y en la estructura 3D y ensamblaje de los componentes proteicos que forman el heterohexámero (?3,4,5)2(IV)NC1 y albergan el epítopo. 1 Caracterización mediante tecnología phage display y bioinformática del epítopo de los autoanticuerpos GP, ya localizado en el dominio ?3(IV)NC1 del colágeno tipo IV. Mientras el estudio del epítopo GP se había abordado clásicamente a partir del análisis del antígeno, aquí obtenemos información del epítopo GP a partir del análisis de los autoanticuerpos GP patogénicos. Para ello, (1) ponemos a punto un sistema de expresión que usa células de insecto y baculovirus que permite la producción recombinante de ?3(IV)NC1 y del resto de cadenas proteicas del colágeno tipo IV humano en forma abundante, funcional y estructuralmente competente; y (2) aplicamos la tecnología phage display y procedimientos bioinformáticos para cartografiar el epítopo para los anticuerpos circulantes de un paciente Goodpasture sobre un modelo de la estructura 3D del heterohexámero (?3,4,5)2(IV)NC1. 2 Establecer las bases estructurales de los dominios NC1 del colágeno IV para comprender la biología y patología asociadas al colágeno IV en las membranas basales. Cristalizamos los seis ?(IV)NC1 y varias asociaciones de ellos para, mediante la resolución de sus respectivas estructuras a nivel atómico, entender el proceso de ensamblaje y formación del protómero en el colágeno IV, así como de las interacciones que lo mantienen y que lo preservan del ataque de los anticuerpos GP. 3 Implicación de GPBP-1 en el ensamblaje del colágeno tipo IV y consecuencias inmunopatogénicas. Mostramos mediante la coexpresión simultánea de ?3(IV)NC1 y GPBP-1 y estudios de resonancia de plasmón de superficie, de estructura de proteínas por cristalografía de rayos X y de caracterización inmunoquímica y de mutagénesis dirigida, que GPBP-1 modifica el plegamiento de ?3(IV)NC1 y la exposición del epítopo de anticuerpos patogénicos. Resultados y conclusiones. Objetivo 1. Hemos aplicado la tecnología phage display por primera vez en la caracterización del epítopo de los anticuerpos GP. Hemos seleccionado péptidos específicos (fagotopos) para los autoanticuerpos GP a partir de dos librerías phage display-M13 de péptidos combinatoriales comerciales que hipotéticamente mimetizan las propiedades físico-químicas y la organización espacial de los auto-epítopos. En base a esta información, hemos generado quimeras, preparadas a partir de la proteína ?2(IV)NC1, que son reconocidas por los anticuerpos GP con similar intensidad a como lo hacen con la diana natural ?3(IV)NC1. Nuestros resultados, no sólo corroboraron hallazgos previos en la definición del epítopo sino que identificaron nuevos residuos (Thr26, Tyr30, Thr127, Pro131, His134, Lys141, Thr99 y Ala196) involucrados en la unión de los autoanticuerpos GP. Además de proporcionar nueva información estructural sobre los epítopos GP, proponemos el uso de nuevos compuestos (péptidos) con capacidad de bloquear la unión de los autoanticuerpos GP a su autoantígeno “in vivo” y aportamos datos cinéticos de la interacción antígeno-anticuerpo que, eventualmente, podrían resultar críticos en la generación de agentes bloqueantes terapéuticos. Objetivo 2. Pretendíamos establecer la estructura del heterohexámero (?3,4,5)2(IV)NC1, que es la diana de los autoanticuerpos en el síndrome de Goodpasture, y trasladar los hallazgos sobre el epítopo obtenidos en el objetivo 1 a una estructura hasta entonces desconocida. No tuvimos éxito en cristalizar tal heterohexámero probablemente por la asombrosa facilidad de uno de sus componentes (?5(IV)NC1) para cristalizar de forma aislada. Sí resolvimos, sin embargo, la estructura atómica, mediante cristalografía de rayos X, de homohexámeros de (?1(IV)NC1), (?3(IV)NC1), (?4(IV)NC1) y ?5(IV)NC1, así como de heterohexámeros de ((?1)2(?2))2(IV)NC1 y de (?5,6,6)2(IV)NC1. La estructura de cada uno de los homohexámeros, excepto el de (?4(IV)NC1), junto con aquella de ambos heterohexámeros, resultó ser extremadamente similar, con un valor RMSD de superposición inferior a 0,8 Å. Todas tienen una estructura hexamérica cuaternaria típica para los ?(IV)NC1, ya observada en el heterohexámero ((?1)2(?2))2(IV)NC1 encontrado en la placenta humana (PDB id:1LI1) y bovina (PDB id:1T61) y en la cápsula de cristalino bovino (PDB id:1M3D, 1T60). Esto demostraba que las nuevas estructuras aquí obtenidas poseen estructura cuaternaria fisiológica, validando, por tanto, el sistema de expresión que hemos usado, así como la idoneidad de los procesos de purificación y cristalización seguidos. El cristal del heterohexámero (?5,6,6)2(IV)NC1 reveló que este protómero no está constituido por dos moléculas de ?5(IV)NC1 y una de ?6(IV)NC1, como se creía, sino por dos moléculas de ?6(IV)NC1 y una de ?5(IV)NC1. La estructura de ?4(IV)NC1 mostró claras diferencias respecto al resto de homohexámeros, evidenciando que las proteínas ?(IV)NC1 pares exhiben menor plasticidad, lo que probablemente sea la causa de y limite su tendencia a la autoasociación. Las diferencias estructurales en ?4(IV)NC1 impiden la formación del protómero y del hexámero al cambiar y limitar las interacciones que se establecen entre diferentes regiones en el resto de proteínas ?(IV)NC1. El análisis de los heterohexámeros ((?1)2(?2))2(IV)NC1 y (?5,6,6)2(IV)NC1 reveló unas estructuras muy similares al resto de monómeros ?(IV)NC1 permitiendo comprender que, una vez los ?(IV)NC1 pares interaccionan con ?(IV)NC1 impares, modifican su conformación para favorecer la formación del protómero, así como para proveerle estabilidad. La información estructural nos permitió concluir que los anticuerpos patogénicos GP se dirigen a dos regiones en ?3(IV)NC1 que comprenden los residuos 15-TAIPSCPEGTVPLYS-29 (región EA) y 125-TDIPPCPHGWISLWK-139 (región EB), dos regiones estructuralmente rígidas situadas en el ápice de los dos dominios estructurales C4. Objetivo 3. Presentamos evidencias de que GPBP-1 influencia la estructura de ?3(IV)NC1, como se observa, tras la co-expresión de ambas proteínas, en la estructura cristalina a nivel atómico de ?3(IV)NC1, en la caracterización termodinámica de la interacción de ?3(IV)NC1 con anticuerpos conformacionales y en su reconocimiento inmunoquímico. Mientras que los resultados inmunoquímicos y mediante SPR son indicativos de que GPBP-1 influencia la conformación de ?3(IV)NC1, el estudio estructural de la proteína ?3(IV)NC1 expresada y no expresada junto a GPBP-1, claramente revela la naturaleza de los cambios mediados por la presencia de la cinasa. GPBP-1 promueve la generación de cristales diferentes (en términos de grupo espacial y moléculas en la unidad asimétrica) a aquellos constituidos por un solo tipo de moléculas de ?3(IV)NC1 (obtenidas en ausencia de GPBP-1 y que son competentes para ensamblarse en hexámeros) por contener también un segundo tipo de molécula de ?3(IV)NC1 modificada (?3(IV)NC1c), sólo encontrada cuando su expresión ocurre junto a GPBP-1, y cuya capacidad de interacción se restringe a trímeros. Los cambios estructurales observados se localizan esencialmente en dos lazos de las regiones I y VI del dominio C4 condicionando la capacidad de ensamblaje de los trímeros en hexámeros. Este hecho se evidencia mejor en el ensanchamiento general de los trímeros originados por ?3(IV)NC1c que impide el ensamblaje con el trímero vecino para formar el hexámero. Además, uno de estos lazos alberga la Lys211 involucrada en un enlace sulfilimina que da estabilidad al hexámero y restringe la accesibilidad de los autoanticuerpos GP por lo que se le atribuye un papel substancial en la patogenia del síndrome GP. La predicción para un heterohexámero (?3,4,5)2(IV)NC1 que contuviese una molécula de ?3(IV)NC1c apuntaría a que se produjese una perturbación de las interacciones con las moléculas de ?4(IV)NC1 y ?5(IV)NC1 vecinas dentro del heterohexámero y una abolición de los enlaces sulfilimina, convirtiéndolo, de este modo, más susceptible al acceso de los anticuerpos GPc. La observación de que la reactividad de los autoanticuerpos GP sea mucho mayor hacia homohexámeros de ?3(IV)NC1 que se han expresado simultáneamente con GPBP-1 que frente a homohexámeros de ?3(IV)NC1 preparados en ausencia de GPBP o frente a formas monoméricas de ?3(IV)NC1 bajo cualquier circunstancia, es consistente con el conocimiento presente del autoepítopo y refuerza la propuesta del papel de la cinasa en la etiología de la enfermedad Goodpasture, quizás facilitando la exposición del epítopo, la activación del sistema inmune y la producción de autoanticuerpos patogénicos. Los resultados de mutagénesis dirigida tanto en ?3(IV)NC1 como en GPBP-1 se complementan y confirman que las modificaciones estructurales observadas en ?3(IV)NC1 cuando se co-expresa junto a GPBP-1 se deben a la presencia de la cinasa. Estos resultados son consistentes con la observación de que la expresión elevada de GPBP-1 in vivo desorganiza la MBG, lo que podría permitir la exposición de epítopos crípticos y desencadenar un proceso autoinmune en el síndrome de Goodpasture y/o un proceso inflamatorio que culminaría en una Glomerulonefritis.